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标题:【求助】荧光定量标准曲线制作

mybioon[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量标准曲线制作


各位大侠来帮帮忙啊！
  最近我做荧光定量的标准曲线，标准品用的是pcr产物（胶回收后），做10倍稀释，第一样CT值9.2，以后分别是25.32，32，31，29，32，做过几次都是这样类似的结果，很乱，扩增效率也达到129左右。稀释的时候，我第一次每个样吹打了上千次，后来又用振荡器震荡，每个样10分钟左右，自己感觉应该是稀释开了的，但不知道怎么还是这个结果，各位高手给点指点吧
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该用反转录后的cDNA做模板。
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.标准品重新稀释
2.加样的不准确
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wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该用反转录后的cDNA做模板。
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hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现在，做好了没？我做标准曲线也不好呢？想请教一下？
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kulee[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
稀释精确度和你震荡的时间不成正比的，稀释的时候尽量不要用枪头吹，没有原因，就是传下来的经验
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nikonun[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问不用枪头吹打 用涡旋器震荡还是怎么地？求指教
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本人试过，用枪头吹的效果还不如我手指弹匀的效果好，不过我的标准品是质粒。
师兄告诉我们，枪头不要再液面下3mm一下，枪头吹液不要超过3下，溶解液用TE，比水好。我也不知道为什么。试试吧，经验就是经验，有时候就是这样
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jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做荧光定量时，稀释探针引物时一般是选择用振荡器还是用手指弹好呢？振荡对探针有什么影响吗？
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-10-26 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题解决了吗？我的做的也不好，想着请教你呢。据我们师姐说过用振荡器的话有可能把引物给震断了，我觉得还是用手指弹吧，温和点。
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