【求助】巨噬细胞分离培养求教！

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标题:【求助】巨噬细胞分离培养求教！

quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近在分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用的是Balb/c小鼠，但是按照文献上和药理学实验方法（徐淑云）上用PBS或1640来冲洗腹腔后得到的巨噬细胞非常少，浓度根本不够实验用。哪位高手知道怎么做才能有效大量地分离到腹腔巨噬细胞，得到巨噬细胞后怎么培养？能传代吗？
真的非常急，望各位给与指点！先谢谢了！

feima+[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知道你是怎么冲洗的
我介绍我的方法
拉颈处死小鼠
剪开腹部皮肤，暴露腹膜（不要把腹膜弄破，你也可以不用剪开，看个人，我习惯剪开，因为好观察），消毒局部
用5ml注射器抽3-4mlPBS打入腹腔，酒精棉球轻轻按摩1-2分钟，再用注射器将腹水抽出来（这就是我剪开腹膜的目的，好观察，因为针头进入和抽液时经常会扎入内脏引起出血，或者有脂肪组织堵住针头的现象），将抽取的液体注入无菌离心管。（好的应该是清亮透明，如果有红色就说明没操作好，有红细胞，这是很麻烦的，你不得不离心弃上清然后加1-2ml蒸馏水震荡30秒低渗破红细胞在马上加入等量2x生理盐水恢复低渗，麻烦且增大污染机会最后细胞得率也不高）
这个过程可以重复2-3次直到收集的腹腔液有4-5ml左右
然后就是离心1500rpm 5分钟弃上清你可以再重复一次洗涤细胞
最后弃上清加入1ml1640培养液悬浮细胞（这个量要少，要不然细胞浓度太稀，你就不好调了）吹打均匀细胞计数调整细胞浓度
一般收集的细胞总数在5x106-1x107个
以5x106算 1ml浓度就是5x106/ml 一般实验浓度是1x106/ml 那再加入4ml1640吹打均匀即可
如果你的细胞还是不够那么只有刺激它文献有介绍采用实验前1星期将肉汤打入小鼠腹腔但是配方不知道我们后来试用含10%小牛血清的1640完全培养基打入小鼠腹腔效果还可以不过不建议这对实验结果有何影响还不太清楚因为刺激会使腹腔巨噬细胞增多也会激活巨噬细胞

feima+[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于培养巨噬细胞是贴壁的文献介绍培养2-4小时取出将未贴壁的细胞冲掉剩下的就是纯化的巨噬细胞我不知道文献是怎么冲洗的反正我是不敢随便冲洗的最多用tip头将培养液吸干净再加入新的培养液冲洗会损失一大部分巨噬细胞
传代肯定是不可能的巨噬细胞是终末细胞，体外不分裂就是慢慢等死呵呵一般换液勤可以维持1周左右所以实验要尽可能短我们一般取出后48小时内用完

quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看了你的操作叙述感觉很详细,我准备调整一下我的操作方法,再试一下.
我原打算按一些文献上说的用巯基乙醇酸钠刺激一下再分离巨噬细胞,据说可以增加巨噬细胞量,且不会激活巨噬细胞,但总觉得还是会对巨噬细胞活性有影响.
另外,你调整细胞浓度时所说的5x106-1x107是从一只小白鼠腹腔得到的吗?如果把几只小鼠的细胞弄在一起培养并用于检测可以吗? 感谢!

feima+[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们也用过巯基乙醇酸钠刺激效果也不太显著
5x106-1x107是一只小鼠的量有时也可能会少点一般可以得到这个量
把几只小鼠的细胞和起来我们当时也考虑过不过后来没有试这里面有一个问题就是小鼠A的巨噬细胞会不会把小鼠B的巨噬细胞当成异物给吞噬了或者说被激活了

feima+[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还想再问shenkunjie和众群友一个问题：腹腔中洗出的细胞中应该还包括淋巴细胞、中性粒细胞等多种细胞，当细胞贴壁之后，怎么确定贴的就是巨噬细胞而不是其他细胞？巨噬细胞在镜下和其他细胞有什么明显不同吗？是否需要通过染色等方法进行检验？

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

建议你用3%酪蛋白（pepton)1ml，给小鼠腹腔注射，一周后，先注入10ml的PBS，混匀后，再慢慢抽出来。这步挺要技术的，要多试几次才成。之后，放到微孔板里培养，我们一般培养24小时后，再洗。说是洗，其实就是去掉上清，再加入新鲜的培养基。巨噬细胞寿命挺长的，我们做过122小时后，再观察细胞长的都还不错。至于鉴定，应该用巨噬细胞表面标记物的抗体鉴定。

leifengta[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

腹腔巨噬细胞灌洗效果好。
而且激活状态对实验影响大。要甚重！

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-11-4 16:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

单核细胞图片

我看到有关的资料上说。小鼠的巨噬细胞分离前应该腹腔注射肉汤刺激巨噬细胞的生成。我个人养的是人的单核细胞（PBMC），然后激活成巨噬细胞，条件不太一样。我们实验室一位老师曾经养过鼠单核细胞，非常的容易。也有一位同学养了很长时间也没有成功。我的倒是已经非常成熟了。不知对你有没有帮助。你可以把你的图片发来看看。我也把自己的发上来。大家交流一下。