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标题:【求助】重新合成的内参引物有引物二聚体该咋办？

##蒙奇奇[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】重新合成的内参引物有引物二聚体该咋办？


最近在做荧光定量pcr，我之前合成的内参引物扩增样品效果还行，引物二聚体很少。后来内参引物用完了，重新合成了两管，结果再扩增，引物二聚体就很多了。做了温度梯度PCR，从57度到64度，各个温度都有引物二聚体。请问这是怎么回事呢？我的反应体系是10ul，引物加了0.5ul，模板1ul，引物浓度时10umol/L的。今天把引物稀释了4倍、16倍、32倍、64倍，结果只有稀释四倍的扩增出条带，但是还有引物二聚体。请问在不重新合成引物的情况下，还可以怎么调整条件？
PS:荧光定量的产物都是挺小的，最大也就200bp左右，我用的反应程序里面72度延伸时间是45秒，请问这会不会导致产引物二聚体增加？减少延伸时间可行吗？减少退火时间呢？
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是在普通PCR上检验的有引物二聚体么？
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##蒙奇奇[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 viviwang1987 于 2014-12-1 15:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你是在普通PCR上检验的有引物二聚体么？

嗯，先做普通pcr试试条件呢。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目的片段和引物二聚体同时存在的吗？
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##蒙奇奇[使用道具]
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发表于 2014-12-1 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对啊，刚才去用稀释到4倍、6倍、8倍的又扩增上了。发现之前扩增程序有问题，效果好的程序里面72度延伸时间是15秒，而温度梯度的程序里面延伸时间是45秒。推测有可能是延伸时间太长导致引物二聚体，我现在把延伸时间调到15秒了，等会看看结果吧。
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发表于 2014-12-1 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
结果怎么样了？一般如果引物特异性好的话有了目的片段很少会再有Dimer呀，Real-timePcr一般用两步法，把后面的退货和延伸合二为一了，普通PCR上为什么步直接设置这样的程序呢
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发表于 2014-12-1 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的片段和引物二聚体同时存在时很正常的，关键是条件的问题
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发表于 2014-12-1 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

摸好条件再做做
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发表于 2014-12-1 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议65度34秒 退火和延伸绑在一起
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