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标题:【求助】扩基因老扩不出来。请求大家给宝贵的建议

sunshine039[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】扩基因老扩不出来。请求大家给宝贵的建议

我的目的片段是220的BP,但GC含量高。55度到62度，都有带，但带特别弥散，连T载体，送测序后，测序公司给的结果.质粒本身浓度

较低或是您提供的菌样提取的质粒浓度较低是希望大家帮我分析一下，这个是从CDNA上扩的，希望大家给出宝贵意见，谢谢


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2014-12-1 16:29
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从你扩增的图上看，有可能是循环数太高导致的产物非特异性扩增。你可以试着减少循环数。这只是一个原因，还有其他的原因，可能是酶浓度高，或者是酶质量不好。都有可能，你先试着降低循环数看看会不会好些。
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果引物设计没问题的话就是酶特异性不好，建议换质量好一点的酶试试
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glass[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
GC含量高可以提高下退火温度试试  不行就多P几管  做胶回收 然后连接载体  鉴定完测序的时候不用送质粒  可以直接送菌液试试
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
升高退火温度试试。。。
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
升高退火温度试试。。。
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发表于 2014-12-1 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

作PCR反应时，加入不同浓度的DMSO (e.g. 0.1%-2%)，以避免GC-rich的hairpin形成
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uaubc[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得很有必要减少一下循环次数  因为我之前也出现过类似的情况
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以考虑使用高GC特异的PCR酶
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以考虑用高GC含量的PCR体系，我用的TAKARA的GC Buffer,LA-Taq，感觉还不错
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