【求助】菌落PCR

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标题:【求助】菌落PCR

free[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的目的基因大约是960bp，这个是我跑的菌落pcr图片，貌似最上面的条带和我的目的基因长度比较接近，MAKER是2000的，但是不知道为什么最亮的条带在500左右，而且出现这么多条带，急求高手赐教！不胜感激！！

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先要确定一下，你挑的是形态饱满的单菌落吗？如果是，你的引物成熟吗？有可能是引物的问题，错配太多了导致特异性不高。还有一个问题是你扩增的片段确定是你的目的片段吗？你可以找个限制性内切酶确定一下，也可以送去测个序。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

重新挑几个单克隆试试，也有可能是PCR和制胶的问题

wiwi[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

错配很高！这种情况下不建议菌落PCR了。先提质粒，单酶切验证。不过也可以单切或双切后在P一下看看！

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个应该是引物特异性不高，不过也应该能p出目的条带，另外你这个跑胶太久了吧，有可能造成条带不太准确。

seagate[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

貌似你960 的条带没有呢，而且杂带多，是不是退火温度没试好，还有用通用引物试试呢

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

挑几个提质粒双酶切看一下

eric930[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人建议一，减少模板量P 或者二，提高退火温度试试

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-12-1 16:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你扩的是细菌的基因组的，出现这么多杂带是正常的，说明你的引物及PCR的条件还是要优化的