【求助】co-ip实验求助

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标题:【求助】co-ip实验求助

987789[使用道具]
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发表于 2014-12-6 08:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

准备做co-ip实验，有非特异性结合，该怎么去除啊？

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2014-12-6 08:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的七海生物 Protein A/G agarose，根据他们说明书的描述，操作上我有些微调，可以这样去除非特异性结合：
1、取1ml蛋白样品，蛋白量约1mg，加入1ug和免疫共沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和 Protein A/G agarose，4°摇动0.5h-2h；
2、3000rpm离心5min，取上清

987789[使用道具]
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发表于 2014-12-6 08:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dragonkilly 于 2014-12-6 08:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我用的七海生物 Protein A/G agarose，根据他们说明书的描述，操作上我有些微调，可以这样去除非特异性结合：
1、取1ml蛋白样品，蛋白量约1mg，加入1ug和免疫共沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和 Protein A/G agarose，4°摇动0 ...

谢谢！那是否BSA预封闭处理呢？

feima+[使用道具]
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发表于 2014-12-6 08:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

我现用的是一个国产的agarose，实验也能做，不过条带总是很淡，不知实验方面有没什么可以改进的地方？另外你用的这个七海生物他们有这问题吗？

feima+[使用道具]
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发表于 2014-12-6 08:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 987789 于 2014-12-6 08:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！那是否BSA预封闭处理呢？

pull-down实验，一般不推荐BSA封闭。一般在实验中发现非特异吸附现象很严重时，才考虑加入BSA。

xue258[使用道具]
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发表于 2014-12-6 09:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 feima+ 于 2014-12-6 08:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我现用的是一个国产的agarose，实验也能做，不过条带总是很淡，不知实验方面有没什么可以改进的地方？另外你用的这个七海生物他们有这问题吗？

七海还不错，性价比蛮高，现在做的多了基本没出现过什么问题。
条带淡建议可以：
1）最简单方法，增加实验样品的量和浓度。每毫升Protein A/G可以吸附20mg以上抗体，一般pulldown实验，proteinAG都是过量的。
2）延长proteinAG和样品的混合震荡时间（例如4度过夜），保证Protein A/G和样品的充分接触。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-12-6 09:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的才结合10mg左右啊，你这个结合力这么高？！

fangxiang[使用道具]
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发表于 2014-12-6 09:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的是chip实验，裂解时用RIPA效果并不好，还有什么裂解液推荐可以用的吗？使用量？

whitesheep[使用道具]
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