蛋白质与蛋白组学

大家好：
我最近在做蛋白质修饰率的测定。可是我每次做的结果都是未修饰和修饰过的在335nm处吸光值都非常低，大概在0.003或0.004。我采用的是TNBS法，具体如下：
1mL蛋白液（修饰蛋白和未修饰蛋白）+1mL4%碳酸氢钠+1mL0.1%TNBS，混匀后40°反应2h，再加入1mL10%SDS和0.5mL1N盐酸，在335nm处读取吸光值。修饰后蛋白质的吸光值/修饰前蛋白质的吸光值为残留氨基酸量。每次测定的结果都非常奇怪，那么低，我感觉不可信，根据原理应该是修饰后的吸光值小于修饰前的吸光值才合理啊。我也不知道吸光值应该在怎样的范围内正常？我们实验室没有人做过，请大家指点一下吧！哪里有问题呢？谢谢

没做过蛋白分析，但看来你的方法有问题。如果试剂没有问题，看你的方法，参比液应该是蛋白空白处理液，是不是蛋白浓度太低了？建议你提高到10-50倍试试。

335干扰应该比较大，要注意控制干扰

楼主，你为何选335nm，我记得蛋白一般在280nm，有相对较强的吸收啊

国家有计量检定规程，用标准物质打进流通池里扫波长，得出的数值与标准的波长值对比，不超允差就合格。

必须用335吗？是规定的吗？不能根据物质来调吗？

选择此波长时候有具体的文献支持？

楼主做的有试剂空白么？

有段时间没来了，谢谢大家的关注。我说明一下，空白就是不加蛋白，用水替代，其他试剂与反应的一致，空白、修饰的及未修饰的均反应2h。我做的SOD的，看文献基本上是335nm。现在吸光度倒是上去了，问题是测定的修饰和未修饰的蛋白二者差值很小，那不就成了没有修饰上吗？我用买的牛血的做了，结果残留的氨基酸达到77%，那不就是都没有修饰上吗。还请高人继续指点啊！