【求助】]第一次做MTT·····已经白忙活了一个月了

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标题:【求助】]第一次做MTT·····已经白忙活了一个月了

xuuuu[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我第一次做MTT····这次铺了两块板：
肝癌Hep G2 细胞：70000个/ml 每个孔100微升
肺癌细胞A549：5000个/ml 每个孔100微升
培养24h后····显微镜下看到细胞连板的40%面积都不到····有些细胞甚至还是圆的···和培养瓶里看到的梭状不大一样······
请问这到底是什么原因？是因为铺板前细胞的状态不太好？还是我接种的密度太小了？
【补充一下····我用胰酶消化Hep G2细胞的时候····显微镜下总能看到细胞成团，请问这是消化过度？还是时间不够？】
请问能继续养久一点么再加药么？请问细胞长到什么程度可以加药呢？80%~90%?
我今年保研进实验室···真的还什么都不懂····望各位师兄师姐指教非常感谢各位！！！！
各位师兄师姐可怜一下我这年二七还在做实验的娃吧·····

ha111[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是你的消化时间过了，导致你24后还是圆的。一般种版24h就可以加药的。HepG-2长得很快的，你种了7万，很快长爆了，可能24h不用，你都看不到底了。你可以先查下怎么培养细胞，多看些视频，对你很有帮助。

quiqui008[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 xuuuu 于 2015-1-14 22:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我第一次做MTT····这次铺了两块板：
肝癌Hep G2 细胞：70000个/ml 每个孔100微升
肺癌细胞A549：5000个/ml 每个孔100微升
培养24h后····显微镜下看到细胞连板的40%面积都不到····有些细胞甚至还是圆的···和 ...

HepG2细胞消化时间太长了。按正常的胰酶活力，1-2分钟就够了。建议消化细胞时，在显微镜下边观察边消化，这样比较容易掌握消化进度。祝好！

baidukk[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

A549，500一个孔是不是太少了啊

jingling845[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

消化液中细胞成团若只是一部分，轻轻振荡可成个分散，个人觉得消化时间足够

xuuuu[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 jingling845 于 2015-1-14 22:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
消化液中细胞成团若只是一部分，轻轻振荡可成个分散，个人觉得消化时间足够

我拿的是0.25%的胰酶消化5min·····肉眼可见一些白色的雾一样的东西···
显微镜下看到有部分是圆的细胞，还有一大团的细胞·····请问这样可以做MTT？

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我记得消化2min就够了啊，5min太长了吧，时间短一点试试

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

估计是消化过头了。如果你进实验室不久，细胞培养细胞消化的实验还是在同实验室师兄师姐的指导下做比较好，有些东西网上说也说不清楚。接种密度，我们以前都是师兄师姐做预实验摸好的条件然后我们直接用了。你可以问问你们实验室的师兄师姐他们一般用多大密度。一般密度太大确实有很多细胞贴不上，但你只有40%的融合度，也不至于呀。

baidukk[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

铺板之后轻微震荡使之贴壁，96孔板特别不好贴细胞，换液容易冲洗掉

baidukk[使用道具]
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发表于 2015-1-14 22:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是你的消化时间过了，导致你24后还是圆的。一般种版24h就可以加药的。HepG-2长得很快的，你种了7万，很快长爆了，可能24h不用，你都看不到底了。你可以先查下怎么培养细胞，多看些视频，对你很有帮助。

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我的的都是4000每孔，刚刚好。不能让细胞长太多，48h后，会长的特别满，结果就不能用了

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