液相色谱

今天用液相色谱做感冒止咳糖浆中黄芩苷含量测定时碰到了难题

色谱条件：岛津10A的机子，N2000工作站，流动相是甲醇：水：磷酸（35：65：0.3），检测波长280nm，理论板不少于3000。

对照品配制：取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。  

供试品制备：精密量取1ml，置50ml容量瓶中，加50%的甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。       供和对各进10ul。

问题出现：第一针对照品，跑了一小时，没任何峰出现，就是基线。
                    第二针对照品，我把波长调到278，保留时间为22.998时出峰，不过峰形难看，而且理论板数只有600多。。。
                    第三针对照品，把波长调到276（因为之前我测黄芩药材黄芩苷含量时用的波长就是276），但保留时间变成31.082？？？理论板数同2针
                    第四针对照品，把波长调到279，保留时间为34.673？？理论板数同2针
                    第五针对照品，把波长再调至276，保留时间为22.948？？理论板数同2针

我昨天做了样品，系统应该是没问题的，对照品溶液也是新配的！！！
问题1：为什么按照药典标准的波长测定无任何峰出现（当然进样也没问题）？
问题2：为什么改变波长会造成保留时间改变这么多？
问题3：为什么柱效这么差？（我用的柱子才用2星期，而且之前所做的样品柱效都不错）

现在都没法做下去了，到底是哪些方面的问题？？？大家帮忙看看！！！

快被你气死了，有你这么做实验的吗，你的这些变动除了让实验变成猜谜游戏外毫无意义。276nm到280nm，吸收差别会大到276有、280就一点也没有的地步吗。保留时间不确定跟波长没关系。

固定一个波长，先做系统重复性实验，至少连续两针表现一致，再改变条件（增加有机相比例）使理论塔板数达标。
或者，以先保证能出峰为思路，先用90%的甲醇走一针（如果没峰就可以怀疑是波长选择问题或者是样品浓度问题），然后逐渐加大水的比例，使有关物质获得分离。

建议在276下连续进样试试，不要每进一个都换波长，因为换了检测波长，无法确定你检测到的色谱峰表达的是同一个物质。管路上有没有漏液，压力，流量正常吗？

如果有很小的漏液（比如流通池有漏），系统会报警吗？选择在276下进样是不是因为药材是在276下检的？但是这改变了标准规定的测量波长，会对检测结果有大的影响吗？

在 276波长下进了三针对照品，保留时间分别为12.798、15.223、22.365，但峰面积相差无几的，为什么会这样？我测了下流速是正常的！！！然后我进样品，保留时间就更离谱了，直接45.658，我还以为不是呢，做了个加标，可以确认是目标峰，这究竟是什么原因造成的呢？
再者，我发现我今天做的系统压力比昨天的低了近20kgf(2MPa)[当然流动相比例也没变动]，如果是有漏的话机子应该会报警，但运行是正常的，这又是什么原因？哪个地方磨损了？不密封？？？

276不是规定的检测波长吗？是不是色谱柱没有平衡好，或是样品污染很大，每进一次都有很大的污染，使用保留时间无法重复。

第一、我今天打开空调再重新做了下，以前没开空调做的，室温大概是25度，以前室温只有差不多15度的样子，室温相差10度会造成系统压力有很大的改变吗？因为我没开空调的时候（15度）压力比开了空调（25度）高了近2MPa，只是流动相高了这么多，然而我冲洗柱子用的纯甲醇基本没什么变化，为什么会这样呢？

第二、我今天做的保留时间是45min（重现性也还不错），不过峰形不太好，峰高不高，不过理论塔板数比较高（毕竟保留时间这么长），而上几次做的怎么会在12.798、15.223、22.365的时间里出峰呢？是不是因为上针的没出来，而在下针出来了？因为我只在40分钟左右就停止采集了

第三、我做样用的波长是276，而药典规定是280，因为280没峰出，我这样改变规定波长做出来的结果可不可靠呢？（我是想反正对照品和样品是在同样的条件下做的，有影响应该会相互抵消吧？？？）

色谱条件：流动相是甲醇：水：磷酸（35：65：0.3），检测波长280nm，理论板不少于3000。

对照品配制：取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。  

供试品制备：精密量取1ml，置50ml容量瓶中，加50%的甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。     
供和对各进10ul。
流速1.0ml/min
你的柱子的类型是不是错了  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子试试！！！

这怎么可能呢！！！！我实验室就只有一种柱子ODS，再说我做液相也有一段时间了，当然不会连C18柱都不认识。

楼主换瓶试剂，重新配制流动相试试，好好混合一下试试。

我也遇到过同样的问题:是单向阈漏了,你清洗一下单向阈,如果不行就换一个新的.