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标题:【求助】请高手指点-pEGFPN1插入目的基因之后转染不成功

bananapeople[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请高手指点-pEGFPN1插入目的基因之后转染不成功

我的目的基因2500bp左右，使用的载体是pEGFPN1，选用的酶切位点是XhoI和EcoRI，目的基因的片段本身带有终止密码子，所以是和GFP分开表达的。

使用的转染试剂是invitrogen的lipo2000，按照说明书进行的6孔板转染和24孔板转染。

48小时之后观察荧光，转染空载体的转染效率较高，有80%左右，但是插入目的基因的质粒转染的孔看不到明显荧光，有绿色的也是几个点，转到白光视野下看好像是死细胞碎片的样子。

已经使用了去内毒素的质粒转染，不知道是什么原因，还请大家多多指教。
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个载体是融合表达的，你的目的片段加终止密码子，后边的荧光蛋白还怎么表达？
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把你插入的终止密码改掉，让它不要终止，接着后面表达GFP基因
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就是嘛，这个载体又没有 IRES，你给他弄个终止密码子，还表达什么荧光蛋白，有荧光才是见鬼了
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9900[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 zwsyrt 于 2015-1-29 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

就是嘛，这个载体又没有 IRES，你给他弄个终止密码子，还表达什么荧光蛋白，有荧光才是见鬼了

弱弱的问一句什么是IRES？
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dmg[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 9900 于 2015-1-29 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

弱弱的问一句什么是IRES？

核糖体插入位点。。。。。
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dmg[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 dmg 于 2015-1-29 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

核糖体插入位点。。。。。

举个例子，plvx-IRES-Zsgreen这个质粒就有插图位点，所以目的蛋白可以和后面的荧光蛋白分开表达，你的质粒是没有IRES的，所以不能分开表达，只能融合表达，如果有了终止密码子还表什么呢
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发表于 2015-1-29 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分开表达和融合表达有什么区别呢？
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9900[使用道具]
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发表于 2015-1-29 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 dmg 于 2015-1-29 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

举个例子，plvx-IRES-Zsgreen这个质粒就有插图位点，所以目的蛋白可以和后面的荧光蛋白分开表达，你的质粒是没有IRES的，所以不能分开表达，只能融合表达，如果有了终止密码子还表什么呢 ...

分开表达和融合表达有什么区别呢？融合表达是蛋白融合在一起吗？怎么分离蛋白呢？
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