小中大【求助】双荧光素酶报告法验证miRNA靶基因
各路同道英雄前辈,目前我要做双荧光素酶报告法验证靶基因,有几个疑问,请大家给予帮助:
1、pGL3-control 载体的荧光素酶载体下游基本没有可以双酶切的单克隆位点,Xba1比较常见,准备用单酶切,但我的mRNA序列里竟然有几处Xba1的酶切序列,请指点~~
2、看有些文献里得到3'UTR是通过提取DNA然后扩增出来的,我想用NCBI中找到的mRNA 3’UTR然后设计引物反转录后pcr扩增双链DNA然后构建到载体上行不?
3、有一个靶基因mRNA的3'UTR全长(无poly A尾)2800对bp,太长了,能不能不用全长克隆到荧光素酶报告载体上?
4、还有共转染miRNA,要合成miRNA。我想知道是合成miRNA成熟体序列及其互补链序列,然后复性形成双链RNA然后直接用脂质体包裹转染吗?如果那样,转染到细胞内会不会被降解呢?
迫切想知道答案,欢迎大家参与讨论!