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标题:【求助】新手请求各位老师分析一下跑出来的怪异峰形

minran_1980[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】新手请求各位老师分析一下跑出来的怪异峰形

本人是一名液相新手，最近才开始学习使用HPLC，之前实验室都是用液相简单的跑一下乙醇，糖类，而我这次需要测的东西是NADH，中文全名为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即常说的还原型辅酶Ⅰ，查阅了许多文献，根据其中的一篇文献资料进行重复试验. 该文献的色谱分析条件为： 柱条件：Agilent1200series，columnstable-C18（250minx4．6mm)柱。 梯度洗脱条件：0min100％bufferA；10min50％bufferA；11min100％bufferA；15min100％bufferA。 流速1．0mL／min， 检测波长：254nm，340nm。 柱温：35℃。 bufferA:PH7.0 PBS(磷酸钾缓冲液） 本人所用柱子为inertsil OS-SP(C18）（150minx4．6mm）柱 用标准样品跑了一张如图，大约9min的时候出峰……如图所示 之后提取了酵母胞内的NADH跑了几次，出现的峰非常诡异，从9min开始，基线都开始不稳了……求各位老师分析下，需要改进什么，新手虚心请教！谢谢！
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gogo[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
     然后再重复标准品，出峰是否还是正常？


     既然标准品正常，问题很可能出现在样品上。


     样品处理最好改进一下
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
又跑了次标准品，正常，在9min左右出峰，基线也比较平稳，准备换个方法处理样品，能跑出标准品是不是可以基本认为这个液相的各项条件是正确的？如果优化的话需要从哪方面下手，请教下您.
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vera+[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

标准品基线也不是很稳啊，可能流动相也需要改变一下，你的样品处理的干净吗？是不是有在主峰后面出峰的杂质呢，如果是，该条件分不开他们的话就会出现基线一直不稳定的情况，你再看看是什么原因
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memory[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你那肯定不是基线的问题，排除色谱柱问题的话，就样品和梯度的问题
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

样品成分可能是很复杂，NADH浓度可能也比较低，除了富集样品外，在梯度方面可以作何改动.
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羊咩咩[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

    可能主要的问题在样品提取步骤上。

    您的样品是如何制备的？
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any333[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你中间怎么有个50％呢？那另外的50％是什么呢？ 感觉样品中杂质好多，还有你是用双通道的吗？把参比波长去掉，看基线会不会好点。
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minran_1980[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
流动相浓度突然变化过大可能会导致基线不稳。你的洗脱条件需要做一下调整。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2015-2-2 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

柱子短了？还没保留好就走了出来
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