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氨基酸的测定——茚三酮比色法

关键词：微粒标准物质  食品检测标准物质  国家环境标准物质  烟煤标准物质
1．原理
  氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波波长为570 nm，据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。
2．仪器
可见分光光度计。
3.试剂
①2％茚三酮溶液：称取茚三酮1 g于盛有35 mL热水的烧杯中使其溶解，加入40 mg氯化亚锡(SnCl2·H2O)，搅拌过滤(作防腐剂)。滤液置冷暗处过夜，加水至50 mL，摇匀备用。
②pH 8．04磷酸缓冲溶液：准确称取磷酸二氢钾(KH2P04)4．5350 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。
准确称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)11．9380 g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀备用。
取上述配好的磷酸二氢钾溶液lO．OmL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀，即为pH8．04的磷酸缓冲溶液。
③氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸(如异亮氨酸)O．200 0 g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度线，摇匀。准确吸取此液10．O mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。此为200µg·mL-1氨基酸标准溶液。
4．操作步骤
①品处理：准确称取粉碎样品5～lO g或吸取液体样品5～10 mL，置于烧杯中，加入50 mL蒸馏水和5 g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40 mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀备测。
②标准曲线绘制：准确吸取200mol·L-1的氨基酸标准溶液O．O、O．5、1．O、1．5、2．0、2．5、3．o mL(相当于O、100、200、300、400、500、600µg氨基酸)，分别置于25 mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4．O mL然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1 mL，混合均匀，于水浴上加热15 min，取出迅速冷至室温，加水至刻度，摇匀。静置15 min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
③样品的测定：吸取澄清的样品溶液1～4 mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上即可查得对应氨基酸含量。
5．计算
X=(c/1000m)100
式中：x——样品氨基酸的含量，µg·(100 g) -1；
    c——从标准曲线上查得的氨基酸的含量，µg；
    m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
6．说明
茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法为：取10 g茚三酮溶于40 mL热水中，加入l g活性炭，摇动1 min，静置30 min，过滤。将滤液放人冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2 mL，冷水洗涤结晶，置干燥器中干燥，装瓶备用。