PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】如何查得到PCR产物的大小啊？

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标题:【求助】如何查得到PCR产物的大小啊？

bs4665[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如何查得到PCR产物的大小啊？


我现有一对引物，已知引物的序列（我师兄留下来的）

目的基因是TRPV1

正义引物cactcctcgctctatgacctg

反义引物gaatctgtcccacttgtcctg

但我目前不知道pcr产物的大小是多少。

请问如何能够查得到该引物跑出来的产物大小啊？

另外，我是使用3%的琼脂糖胶，核酸染料染色。怎么会marker那么暗淡呢？marker当时加了3ul。

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发表于 2015-2-15 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充，目的基因哪里我标示的两条带，跑在前头的不会是二聚体吧？
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发表于 2015-2-15 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

GAPDH多大，二聚体和GAPDH大小相近？？
（但是看亮度，又很像凑热闹的二聚体）
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8s5g[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
marker 一般5ul ，marker 都看不到，你的胶浓度太高了。一般0.8%-2%。先可以 在 ncbi中下载 你这个基因的序列 ，然后用引物做本地blast，就可以看到你设计的引物所扩增的片段大小
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Ao7[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Marker可能是降解了，DNAMarker一般不能加热的，下次换管新的，加大点了，最前面的带应该是引物带，后面的两条明显的带应该是PCR产物，把带切下来后胶回收连接T载体，华大测序，就知道PCR产物是什么，给个建议，以后做PCR加个负对照，没有模板的
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summerxx[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这段引物扩增的是人的TRPV1吗？模板是基因组DNA还是cDNA？
以cDNA为模板我查到的扩增产物大小是156bp，如果是基因组为模板就还要加上一个内含子的大小。
还有其中上游引物并不是完全匹配的，有两个碱基不匹配（种属原因？），但是应该对PCR没有太大影响。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 Ao7 于 2015-2-15 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Marker可能是降解了，DNAMarker一般不能加热的，下次换管新的，加大点了，最前面的带应该是引物带，后面的两条明显的带应该是PCR产物，把带切下来后胶回收连接T载体，华大测序，就知道PCR产物是什么，给个建议，以后做PCR加个负对照，没有 ...

marker是借别人的，所以具体情况也没有问清楚。不过marker应该没有加热啊。

谢谢你详细的分析，但如果拿到华大测序那就比较麻烦了。
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bs4665[使用道具]
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发表于 2015-2-15 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 summerxx 于 2015-2-15 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你这段引物扩增的是人的TRPV1吗？模板是基因组DNA还是cDNA？
以cDNA为模板我查到的扩增产物大小是156bp，如果是基因组为模板就还要加上一个内含子的大小。
还有其中上游引物并不是完全匹配的，有两个碱基不匹配（种属原因？），但是 ...

我这是豚鼠的TRPV1，以cDNA为模版。

那如果人类的TRPV1产物大小是156，那能不能认为豚鼠的也差不多呢？

因为我不懂得怎样blast啊。555555.。。。。。。。。。。。
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bs4665[使用道具]
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 小中大


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原帖由 Ao7 于 2015-2-15 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Marker可能是降解了，DNAMarker一般不能加热的，下次换管新的，加大点了，最前面的带应该是引物带，后面的两条明显的带应该是PCR产物，把带切下来后胶回收连接T载体，华大测序，就知道PCR产物是什么，给个建议，以后做PCR加个负对照，没有 ...

嗯，好!
明后天有空就做一个负对照看看
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发表于 2015-2-15 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 8s5g 于 2015-2-15 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
marker 一般5ul ，marker 都看不到，你的胶浓度太高了。一般0.8%-2%。先可以 在 ncbi中下载 你这个基因的序列 ，然后用引物做本地blast，就可以看到你设计的引物所扩增的片段大小
...

弱弱的问，blast要用什么软件啊？
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