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标题:【求助】 请教同源克隆高手

pulala[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 请教同源克隆高手

最近老师给了一个课题，要我做同源克隆，我比对了七种物种的氨基酸序列，在保守区设计了上下游的简并引物，但做了几次pcr都没有条带，有的只是引物二聚体。是不是pcr体系及反应温度的设定有何区别于普通pcr的地方呢？望做过同源克隆的高手帮忙解答一下，万分感谢！
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bongte[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
把你比对的结果发上来，以及你的引物也发上来看看，先分析一下引物再查找其他原因
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pulala[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

本帖最后由 qazhaoer 于 2010-12-21 22:54 编辑


Mt-ADD71138  EDPRRVIHSLKVAFAITLVSTFYYLK---PLYDSFGSSAMWAVMTVVVVSEFSVGATLGK 93
Gm-ACC60273  DDPRRVIHSLKVAVALTSVSLVYYSR---PLYDGFGVAGMWAVLTVVVVFEFSVGATLSK 102
At-ABF22743.1EDPRRIIHAFKVGLALVLVSSFYYYQPFGPFTDYFGINAMWAVMTVVVVFEFSVGATLGK 76
Db-AB081803  EDPRRVAHSLKVGLALALVSVVYFVT---PLFNGLGVSAIWAVLTVVVVMEYTVGATLSK 104
Sc-ABY52957  EDPRRVAHSLKVGLALALVSAVYFVT---PLFNGLGVSAIWAVLTVVVVMEFTVGATLSK 97
Zm-ACG38733  DDPRRVAHSIKVGLALTLVSVLYYVR---PLFNNWGVSTMWAVLTVVVVMEYTVGGTLSK 107
Hv-EF424084  EDPRRVAHSLKVGLALTLVSVLYYVT---PLFKGFGVSTMWAVLTVVVVMEYTVGGTLSK 116
             :****: *::**..*:. ** .*:     *: .  *   :***:***** *::**.**.*

。。。。。。。。。。。。。中间部分省略。。。。。。。。。

Mt-ADD71138  RWEPCHGRFRFQYPWQQYQKIGNLSRQCAYRIDALNGFLNNFTKTP------KEIKSKIQ 322
Gm-ACC60273  RWEPGHGRFRLRHPWEQYLKIGALTRECAYKIETINNYLNPGIQVS------LEFKCKVQ 329
At-ABF22743.1EWEPPHGQFRFRHPWKQYVAVGALLRQCAYRIDALNSYINSDFQVP------VDIKKKLE 307
Db-AB081803  KWEPRHGQFRFRHPWSQYQKLGTLCRQCASSMEALASYVITTSKTQCPAAANPELSCKVR 341
Sc-ABY52957  RWEPRHGQFRFRHPWSQYQKLGTLCRQCASSMEALASYVITTTKTQYLAAANPELSFKVR 334
Zm-ACG38733  KWEPCHGKFKFRHPWSQYQKLGALSRQCASSMEALASYVITLTRTEYPEAR-PELRSEVR 340
Hv-EF424084  KWEPGHGKFGFRHPWSQYQKLGALCRQCASSMEALASYVITLQKSQYPEAN-PELTFKVR 349
             .*** **:* :::**.**  :* * *:**  :::: .::    :         ::  ::.

红色区域是我选的保守区域
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发表于 2015-2-15 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
5’-ATG TGG GCN GTN YTN ACN GTN GTN GTN G–3’
Gm-ACC60273        ATG TGG GCT GTT CTG ACA GTG GTG GTG G
Mt-ADD71138        ATG TGG GCT GTT ATG ACT GTT GTT GTT G
At-ABF22743.1      ATG TGG GCT GTC GTG ACC GTC GTT GTT G
Db-AB081803        ATA TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Sc-ABY52957        ATA TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Zm-ACG38733        ATG TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Hv-EF424084        ATG TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
上游引物 cDNA-F: 5’-ATG TGG GCT GTB NTS ACC GTB GTB GTB G -3’
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pulala[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
郁闷，图片贴不上了，只能一个一个敲了

5’-ATG TGG GCN GTN YTN ACN GTN GTN GTN G–3’
Gm-ACC60273   ATG TGG GCT GTT CTG ACA GTG GTG GTG G
Mt-ADD71138   ATG TGG GCT GTT ATG ACT GTT GTT GTT G
At-ABF22743.1 ATG TGG GCT GTC GTG ACC GTC GTT GTT G
Db-AB081803   ATA TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Sc-ABY52957   ATA TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Zm-ACG38733   ATG TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
Hv-EF424084   ATG TGG GCC GTG CTC ACC GTC GTC GTC G
cDNA-F: 5’-ATG TGG GCT GTB NTS ACC GTB GTB GTB G -3’ 下游引物
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的也是这个问题诶～

有没有可能，在保守区域中，比如选一段（800bp）设计引物，目的产物700bp，但在目的物种中出来却是500bp左右，我打算测序看看。。。
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发表于 2015-2-15 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.降低pcr反应温度，我们都是40度做，没有带再将。2.提高引物浓度，是普通pcr的5倍以上。3.模板质量要高。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.降低pcr反应温度，我们都是40度做，没有带再将。2.提高引物浓度，是普通pcr的5倍以上。3.模板质量要高。

==============================================================

在下正在学习同源克隆，QQ：1053453683。如果不介意，希望给俺指导指导。谢谢！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2015-2-15 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做不来很多事因为引物问题 我做了六对引物后才做出了目的条带 而且不是很亮  用在线软件简并引物软件设计看看
建议新手 在线软件与自己设计同步进行
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