【求助】新到细胞冻存后复苏，大量细胞死亡

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标题:【求助】新到细胞冻存后复苏，大量细胞死亡

969[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教大家问题，我买的新的细胞株，刚到后，传代一次，进行冻存。冻存20天后，复苏细胞，结果大量的细胞死亡。我一直沿用的冻存方法及试剂，从没出过问题。我猜想是不是细胞刚到后，传代培养一代，这之间用的是原细胞培养液，但二代以后的细胞培养基就用我们的培养基了，而这时候已经冻存了，复苏以后的培养基也是我们的，是不是它还没有完全适应现在的培养基而造成的大量死亡呢？传几代以后在冻存，是不是就不会有这种现象了呢？还是DMSO浓度高了，293T一直用的10%，区别就是这次是新细胞。
因为我没有冻过刚到的细胞的经历，请教大家什么原因？

dreaming[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你能否说一下你是怎么冻存细胞的？还有DMSO浓度是不是可以降低一下啊，5%就OK啦，你传代培养后用的培养基是哪种？

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

突然换培养基肯定是有影响的，，，

969[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 dreaming 于 2015-2-24 12:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你能否说一下你是怎么冻存细胞的？还有DMSO浓度是不是可以降低一下啊，5%就OK啦，你传代培养后用的培养基是哪种？

冻存细胞过程：提前配好冻存液4度存放
将细胞消化好，1500rmp离心后，弃上清，用冻存液将沉淀重悬起来，动作轻柔。
传代用的培养基就是养细胞用的10%DMEM

cbou876[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

保种前细胞状态必须很好才行

nikonun[使用道具]
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发表于 2015-2-24 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我今天刚复苏了293T，你也是293T？应该没什么大问题，DMSO标准的10%没问，然后90%全培养基，冻存我都没有用冻存盒，就是81格纸盒子，第二天转液氮！你冻存的细胞一支大约有多少？还有293T不需要双抗。那个与你的冻存液的存放没关系，你时间短配好了就在超净台里放着一会也没事，我们基本上不往冰箱里放，太麻烦。还有我记得要是放冰箱应该是-20吧，具体的我忘了，因为没放过几次

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发表于 2015-2-24 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有293T不能消化时间长了，别的细胞一分钟，这个细胞顶多30秒，都不用拿到孵箱里去消化，在超净台里呆一小会轻轻一拍就掉下来了，记住冻存的时候要离心。复苏的时候一定不要离心的，直接加培养基

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发表于 2015-2-24 13:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 nikonun 于 2015-2-24 13:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
还有293T不能消化时间长了，别的细胞一分钟，这个细胞顶多30秒，都不用拿到孵箱里去消化，在超净台里呆一小会轻轻一拍就掉下来了，记住冻存的时候要离心。复苏的时候一定不要离心的，直接加培养基
...

谢谢你。我发现这个细胞也很好消化，复苏的时候我都不会离心的

tianmei001[使用道具]
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发表于 2015-2-24 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 969 于 2015-2-24 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

冻存细胞过程：提前配好冻存液4度存放
将细胞消化好，1500rmp离心后，弃上清，用冻存液将沉淀重悬起来，动作轻柔。
传代用的培养基就是养细胞用的10%DMEM ...

你不应该继续用原来的培养基样养着。
来的时候说明书应该好好看看，那上面有详细的说明

nikonun[使用道具]
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发表于 2015-2-24 13:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 969 于 2015-2-24 13:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你。我发现这个细胞也很好消化，复苏的时候我都不会离心的

复苏是不要离心的，对293细胞影响很大