小中大1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染
细菌污染
细菌污染较常见的有大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单孢菌等。加用抗菌素的培养液可预防和排除个别一般少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现，多数情况下培养液短时间内变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显浑浊现象；有时静置的培养液起初不混，但稍加震荡，就有许多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，有时在细胞表面及周围有大量细菌存在，细胞停止生长并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以明确细菌种类；有的培养液改变不明显而有疑似污染，亦可向肉汤培养基内地入少量培养液，37度培养以检测。
处理：一般用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48小时后再换常规培养液，有时在早期污染时此法有效。细胞培养中用抗生素多为预防细菌污染，一半多联合应用。一旦发生污染后再使用抗生素常常难以根除，有的抗生素只有抑菌作用而无杀菌效应。
支原体污染：支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群
或中央束。
支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。
为确定有无支原体污染可做如下检酗：
①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察．支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。
② 荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的 Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗．置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min．向细胞面滴加pH5．5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。
③电镜检查；用扫描电镜方法简便快速．也可以利用透射电镜。
④DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高．但方法较为复杂
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处理：
（1） 加温：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放在41度作用4~5小时，最长不超过18小时，以杀灭支原体。但如此高的温度对细胞生长本身也有影响，因而在实验前先用少量细胞膜所最适合的温度和时间，以尽可能保证杀灭支原体而细胞本身又不受损伤。
（2） 动物体内接种：将受支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借体内的免疫系统杀灭支原体。待一定时间后，取出做原代培养再繁殖。
“黑胶虫”在细胞培养中是一个令人头痛的问题，小生尽管刚开始做细胞培养，但在自己培养的细胞中也出现过“小黑点”，在高倍镜下似乎能看见其有不规则的运动，并且其生长与细胞的生长有此消彼长的关系，即当细胞状态好时小黑点会相应的减少；反之则增加，似乎有细胞竞争生长的关系，但总的来说它的出现并不影响细胞的生长。小生经过每天换液，PBS冲洗，细胞中的小黑点逐渐减少，最终消失（在之后的换液传代中，偶尔会在镜下看见个别的小黑点）。在此过程中小生也看了一些关于“黑胶虫”的资料，发现其实它是实验室中普遍存在的一个问题，国内外对“黑胶虫”并没有一个明确的定义。小生更加偏向于不存在所谓的“黑胶虫”问题。首先小黑点并不影响细胞的贴壁生长，这是与大部分微生物污染不同。其次，培养过程中出现的小黑点只是状态差的细胞发生死亡后形成的，可能是一个凋亡小体，也肯能是细胞碎片。当细胞状态好时，自然这些小黑点就会减少。第三，当颗粒的直径足够小，在液体中作不规则布朗运动也是正常的。当然这些只是小生的一些愚见，希望园子里的各位达人一起探讨，共同进步。
细胞交叉污染
细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染没有微生物存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性，形态发生变化。有些变化轻微，不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势而最终压过原来细胞而导致细胞生长的抑制，最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯，无法进行实验研究。
防治及处理：（1）在进行多个种类细胞培养操作时，所有器具要严格区分，最好作上标记以区分。对每一种细胞按顺序进行操作，避免一起操作时造成的混乱。（2）进行换液或传代操作时，注射器或滴管不要接触培养瓶瓶口，避免把细胞带到培养液瓶中。在进行其他细胞操作时导致细胞污染。（3）所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。
