液相色谱

大家好。
测量一种小分子的药物。测试条件是Waters的仪器，用C18柱，内径4mm，自动进样。
按照文献报道，采用的流动相  A：PBS(M=0.08M,pH=3),  B：乙腈 A：B=65：35

在实验过程中遇到如下问题想请教下大家。
1. 配置PBS缓冲液后，用孔径0.45的PALL滤纸在砂芯漏斗上减压过滤过滤。因为先过滤的纯水，没什么问题。接着过滤PBS缓冲液的时候，流速特别慢，几乎是到了每秒才一滴，影响了实验的速度。经检测，不是漏斗的问题，因为先前过滤水的时候没问题；滤纸拿下，直接用砂芯漏斗抽滤纯水也没问题。于是怀疑是滤纸有问题。我每次都是用同一张滤纸先过滤纯水，再滤PBS。想问下大家，用0.45的滤纸过滤PBS为什么会那么慢呢? 会堵塞滤纸吗？


2.看到大家议论说，PBS缓冲液的浓度不能太大。我采用文献中的0.08M，与乙腈的比为 65：35，没有发现柱子被堵。请问这样子是不是很冒险啊。还是把浓度降低到0.01M比较保险？

3. 测试前，要将准备走PBS的通道先用纯水冲先冲洗30min是吗？比如我准备用A：PBS，B：乙腈，实验开始的时候先用乙腈稳定仪器30min,一般都是再直接用和实验条件一样的流动相配比平衡柱子1h。此次实验中因为有PBS，是不是再应该用纯水冲洗B通道冲洗30min 呢？如果是，那么此时的冲洗条件该怎么设置，乙腈和水的比例为多少比较合适呢？

4. 实验结束后，也需要用纯水冲洗色谱柱。我直接将通PBS的通道换成纯水，然后用水：乙腈=95：5冲洗30min， 再用乙腈冲洗30min。最后将色谱柱保存在纯乙腈中，这样是否合理？

5.两天两次相同条件的实验，我就测一个纯的HPLC级的物质，出峰时间由7.2min推迟到8.2min左右。这会是哪些原因引起的呢？我实验的温度是仪器恒温30度。

谢谢大家！

1、堵？操作问题？
2，不冒险，柱子和仪器，这点盐浓度还是可以耐的
3、要用高水相过渡，否则有盐析，比如70：30 H2O:ACN
4、合理
5、可能室温不稳定

1、PALL滤纸是干嘛的？应该用HPLC专用的水系滤膜过滤。
2、没事，还有用0.1的呢
3、B通道不是一直通乙腈吗，所以B通道不用拿水冲。A通道以前通纯水，现在直接换成缓冲液就行了。即先用A（水）：B（乙腈）=65：35冲十分钟，再把A换成缓冲液就成了。
4、可以，但最好先用水：乙腈=65：35过渡一下，以免柱压突然过高
5、两天只测了两针吗？这就可能是系统未稳定造成的。如果都是做过系统稳定性后测的而发生保留时间漂移，就可能是色谱柱被污染了，是不是伴随了柱压升高的现象呢？

1、堵？操作问题？
2，不冒险，柱子和仪器，这点盐浓度还是可以耐的
3、要用高水相过渡，否则有盐析，比如70：30 H2O:ACN
4、合理
5、可能室温不稳定

谢谢交流。
我过滤的操作应该不存在问题的，因为直接拿过滤完纯水的装置再过滤PBS的。滤纸是PALL 公司0.45的。一般过滤PBS会堵吗？
室温不稳定也有点可能~

谢谢交流。
1. PALL 是US的一个公司，我用的是他家的滤纸，水系，0.45的。就是不确定为什么会流不动PBS。
3.我是每次都将水相和有机相的通道交换使用，以防止滤头长菌的。
5.不是两天只进了两针。我是第一天测得一个样，不同浓度，均是在7.2min出峰，第二天也是同样条件，却在8.2min出峰的。柱压变化不大呢。

谢谢交流。
1. PALL 是US的一个公司，我用的是他家的滤纸，水系，0.45的。就是不确定为什么会流不动PBS。
3.我是每次都将水相和有机相的通道交换使用，以防止滤头长菌的。
5.不是两天只进了两针。我是第一天测得一个样，不同浓度，均是在7.2min出峰，第二天也是同样条件，却在8.2min出峰的。柱压变化不大呢。

不知道说的对否，仅供参考：
1、新鲜配制的缓冲液没有遇见过流速很慢的问题，每次从冰箱中拿出来会有堵的现象，应该是有颗粒析出吧。
2、资料中一般好像是不大于0.05M。
3、我一般做含盐的品种，平衡时是用含有机相10%的水冲30min。
4、实验结束我也是用含有机相的水冲，纯水冲对柱子不好吧。
5、两次用的流动相是一瓶吗？有没有完全平衡。时间漂原因很多，不知道你的具体情况。

谢谢交流，对我帮助很大。
两次的流动相不是一瓶，每次都是单独再配的，
可能这也是保留时间变化的一个原因吧。