扫描电镜之家

弧菌的电镜实验，曾经做过一次，按照下面的步骤做的，但是效果不好，细菌拍下来不立体。
将菌液以3000r /min转速离心10min后，弃上清液。注入 2.5%戊二醛，静置2h以上固定。固定后离心，将细菌沉积，弃上清，以蒸馏水重悬浮，重复3次，最后以蒸馏水重悬。分别用30%、50 %、70 %、80%、90%梯度浓度酒精脱水，每个梯度中静置 10min，脱水完毕，用纯酒精脱水 3次，每次30min，然后用纯叔丁醇置换酒精3次, 每次30min，最后吸取混匀的细菌-叔丁醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，置冷冻干燥机内真空干燥。
有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？

按以下步骤制备扫描电镜样品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸缓冲液洗涤 3 次→乙醇梯度脱水（分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→
乙酸异戊酯置换乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后经 8000 r/min 离心 5 min。将样品分别在 20℃、40℃和80℃冷冻 12 h，于冷冻干燥仪中干燥 12 h，备用。

我是这么做的。根据你的描述，有以下问题：①戊二醛固定时间不够；②洗涤液不能用水，必须用磷酸缓冲液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分别溶于1 L水中，然后将二者按照7:3的体积比混合（V:V），就可以了。）；③不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛应该用以上的PBS来配置；④酒精梯度脱水，顾名思义就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%来脱水是不行的，因为浓度太高，细胞形态就严重变形；按照我的这个梯度，我做出来非常漂亮；⑤ 在冷冻干燥前，必须把脱去自由水的样品按照从-20→-40→-80的梯度冷冻，目的把结合水固定住，梯度原理与④相同；⑥ 乙酸异戊酯的目的是置换掉乙醇，该药品神经毒，请在通风橱进行，不过只是有机物而已，偶尔接触没关系，不用怕。凡药品都有毒的。无法附图片，不然给你看看我拍的。希望对你有帮助。

补充一下：PBS也是保护细胞形态的，原理你应该懂得。

“有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的时候，静置10分钟后，是不是需要离心，然后弃上清，再加下一个梯度的酒精干燥？这个地方一直想不通，如果不离心的话，酒精中的水分不是一直都无法散去吗？”这个肯定都要倒掉的啊

。每一步，不仅仅是乙醇脱水这个，全都要弃上清啊

我的细菌样品如果处理好，4天后才能拍电镜的照片，会不会影响结果？如果不影响，我是放在-80℃里保存4天呢，还是放在-20℃呢？谢谢啦

处理好了就是冷冻干燥了，这才叫处理好。如果还没条件冷冻干燥那就可以现在-80放着，要冷冻干燥了再拿去干燥。如果你是冷冻干燥后，要保存，只能放在有干燥剂的地方，如果你这个也不知道就没法指导了。好像你很多都不知道啊？说得也不清不楚，我往往要两头解释

冷冻干燥的目的一是出去结合水，使电镜时不会被干扰。还有就是为了形态稳定，毕竟在处理过程中有了固定化的步骤。你还是好好理解下各个步骤的原理吧

我只不过想早点把样品处理好，我们学校里的电镜实验做起来要排队，我怕样品处理好了，不能保存，细菌会变形。你的意思就是不能马上做电镜实验，就先-80度冻起来，要拍电镜照片之前的12小时去冷冻干燥，省的干燥完了不能马上做实验，又吸潮了呗