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标题:【求助】用水都能PCR出条带来

莓菓333[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】用水都能PCR出条带来

最近做实验，很久都P不出来东西。经老师指导，换了一组pcr用的试剂。p倒是p出来东西来了，可是，在用水做空白对照组也出现特异性条带来。假阳性特厉害。后面我只用水做模板，加什么引物就出现相对应的特异条带。同时，我做了很多组实验，一种一种地换试剂，可是还是出现假阳性，就是找不出是什么原因来。请高人指点。我把电泳图跟大家看看

图中，左边第一泳道是BS2000 marker 第二泳道是LC3质粒及其对应引物p出的产物，第三、五泳道是G3PDH引物用水p出来的产物，第四、六泳道是LC3引物用水p出来的产物（区别在于水的来源不同）。请高人指点！！


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xue258[使用道具]
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发表于 2015-3-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会是移液器或者吸头污染了
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发表于 2015-3-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哎呀！跟我遇到的问题一样啊！我感觉有两个可能：一是气溶胶的污染，是不是你之前一直在做这个基因？第二可能是吸头的污染，现在有一种吸头是带过滤塞的，可以考虑用那样的吸头。我现在考虑的解决方案：实验前先把用到的吸头、移液器等材料在紫外灯下照射再实验。
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发表于 2015-3-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

嗯   把你用的超纯水  换一换试试
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发表于 2015-3-10 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最关键的是酶和水，天根的酶还不错，直接买mix扩，里面有配套水，那个水是DEPC处理过的，引物千万别污染了，建议引物稀释成母液，取一点出来再稀释，若污染了就扔了，拔母液拿出来重新稀释，用mix加样污染的概率比较小，我都是拿个进口的1.5mL管子把mix、水和引物混合加好，涡旋离心就可以分装PCR管，注意在超净工作台里面加样，别乱讲话，小心唾沫飞进去，还有枪头、管子、PCR管子直接用进口的Axygen的不错，无需灭菌，价格也蛮便宜的，我解决1个阴性对照的问题都花了将近1个月，实验都这样子，有时找不到原因，祝你好运！
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发表于 2015-3-10 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酒精擦拭移液器
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 小中大
我觉得是你的loading污染了
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发表于 2015-3-10 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，好像和loading buff 没关系 因为P初代不一样大，请问第二道也加水还是没加水，若加水了，为啥没P出3456的情况，这很可疑，如果加水了，没P出3456，不太可能是水污染；另外 3456P出来东西很浅，说明模板应该很少，应该是操作时有什么地方污染了吧，考察一下引物，另外就是2道与46道是一样大的，有什么地方交叉操作吗？我就推测这些，祝早日解决
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发表于 2015-3-10 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

试剂换换，试试吧
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莓菓333[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 xue258 于 2015-3-10 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

会不会是移液器或者吸头污染了

吸头都是灭菌的，移液器倒是没有照紫外
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