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标题:【转帖】【分享帖】制药技术精华帖汇总（一）

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 小中大

【转帖】【分享帖】制药技术精华帖汇总（一）

高压蒸汽灭菌器的一种验证方法



除少数培养基只需加热溶解，不需高压灭菌外，大部分培养基均需121℃高压灭菌15-30分钟。尤其是对无菌试验培养基灭菌不彻底，直接关系到试验结果。因此必须认真对高压灭菌器进行灭菌效果的验证。  

1．试验材料

(1)嗜热脂肪芽胞杆菌纸片。嗜热脂肪芽胞杆菌是本法常用的生物指示菌，含芽胞量5-lO5 CFU/片。

(2)121℃压力蒸气灭菌化学指示卡。

(3)溴甲酚紫胨水培养基116℃高压灭菌20分钟后备用。

(4)O-150℃留点温度计。

2．方法与结果

       将嗜热脂肪芽胞杆菌纸片（以下简称菌片）用无菌镊子放人密封试管中。化学指示卡和留点温度计放入敞口试管中。以上两种试管各准备5-10份。分别放置在高压灭菌器蒸气口处、底部排气口处及底部出水口处或上下左右中间5处。如灭菌器为二层，则需放10处。

       留点温度计标化合格后方可用于验证试验。检测前，需将温度计的水银柱甩至40℃以下。每次监测后留点温度计的温差应存1℃之间，则说明灭菌器内的温度分布是均匀的。

       灭菌后的菌片应在严格无菌操作条件下放入灭菌后的溴甲酚紫胨水培养基内56-60℃培养24-48小时，观察颜色变化。如培养基变为黄色，说明菌片中的嗜热脂肪芽胞杆菌尚未完全灭活，细菌仍可在培养基中生长，分解葡萄糖产酸变为黄色。如培养基颜色不变化仍为紫色，则说明芽胞已灭活。同时要用未经灭菌的纸片放入培养基内作为阳性对照，不加纸片的空白培养基作为阴性对照。

       化学指示卡上的指示色块，在高压蒸气灭菌时，由淡黄色变为黑色。随着颜色变化的深浅，并与对照色相比，可判断灭菌效果是否达到要求。化学指示卡应在干燥处保存。遇潮会变色，影响灭菌效果的观测。

       高压蒸气灭菌必须使蒸气顺利进入灭菌器内，与灭菌物品接触，并将原有的冷空气排出方可达到灭菌的效果。要进行空载热分布和满载热穿透力验证(满载时不超过总体积的2/3)。二种验证各重复三次，共做六次。

      5个点六次试验表明温度均在121℃，化学指示卡变黑；程度与对照色一致；培养基均未改变颜色，说明高压蒸气灭菌效果合格。

       高压灭菌器属于强检仪器，但强检只是对仪器物理参数的考核。所以做过强检的灭菌器还必须进行灭菌效果的验证。一些单位常常忽略了这个重要的问题。国内市售的手提灭菌器，往往仪器指针达到所需的温度，但灭菌物品的实际温度却未达到要求。导致灭菌物品不彻底，影响实验结果。培养基灭菌不彻底，影响培养基的使用及结果判断。因此高压蒸气灭菌器无菌效果的验证是一个必须引起重视的问题。

[ 本帖最后由 生物迷 于 2015-3-11 22:12 编辑 ]
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 小中大

培养基灌装的培养温度到底是多少？



前段时间看了某位蒲友发了个帖子，问培养基灌装的温度为什么要先低温再高温，能不能先高温再低温。刚刚看了这个帖子，心里有些不在意，怎么还有人问这个问题，真是新人。准备回给他，因为大家就是这么做的。但是想想，自己身为版主，一定要以理服人，随便找个资料，教育教育这位朋友，要多查资料，少问问题，自己学会找到解决问题的方法。
对于验证，首先想到的资料自然是有着验证圣经之称的《制药工艺的验证》（2012年版，中文翻译版），翻开第22章，制剂生产的无菌工艺：组织与验证，培养时间和温度章节（page 365）中，是这么描述的“培养时间及温度在许多公司里面曾经一度是具有更多争议及变化的做法之一（4，11)。所选的方法包括7 天培养后从一个温度转移到另一个温度的多种温度下的培养。人们甚至困惑，是否开始应在一个较高的温度[ ( 3 0 ～3 5 )]培养然后转人较低的温度[ ( 2 0 ～2 5 )] , 或者开始在一个较低的温度培养然后移到一个较高的温度。不管所选的真实条件如何，人们已认识到促生长试验必须进行，这种认识导致采取了一个更广泛的明确的做法，即培养温度可以在20~35内变化，其中还包括1 4天内进行单一温度的培养。假如选择的温度是同样的（通常范围是亇2.5°C)，使用一个培养温度易于进行模拟灌装并伴有良好的促生长结果，是适用的。该做法使方法具有了灵活性，因此可以适应微生物复活的最大可能。”

第23章药用化学品无菌工艺验证，培养检查章节（page 376）的描述是“除了与获得待培养物料相关的复杂性（或者是大量的可以检查的洁净容器或是一个单一的膜过滤器，促生长培养基），培养这些物料是容易解决的。物品放在一个25 ~35  培养箱里（在某个单一的温度，所有的地点在2 .5°以内）培养14天。可以使用替代的培养方法，如果促生长要求能得以满足的话。培养后容器检查使用的方法与最后制剂所用容器的方法相类似，允许使用大规格的容器。在完成检测后，检测中所用培养基的样品应该有其促生长特性的确认。”
第24章，手动无菌工艺验证，培养时间和温度（page383），中的描述是可采用23章的方法。
汗，这不科学啊，完全和以往的认知不同啊，要是把这段引用了，不是显得俺经验主义了，但是俺肯定也没记错啊，难道是资料没有找对？嘻嘻，小版我除了肉多兄弟多，就是资料多了，对于工艺验证，权威的技术资料莫过于PDA的指南了，于是俺翻开箱底，找到了PDA22、PDA28及PDA62号报告。
PDA22号报告（2011年版）：
7.13 Incubation Conditions
Prior to incubation, filled APS units should be inverted or manipulated to ensure contact of the medium with all internal surfaces of the closure system before they are incubated. APS units should be incubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method.The temperature chosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found in the environment or in the product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35°C may be used (6). Data should be available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selected temperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period.
PDA28号报告：
见附图

PDA 62号报告（2013年版）：

8.10 Incubation Time/Temperature培养时间/温度
The same incubation methods used for a u t o m a t e d machine-based aseptic processing are appropriatefor MAP and can b e f o u n d in PDA Technical Report No. 22 (6):
用于自动机械无菌工艺的培养方法也适用于MAP，可以查看TR22：
Prior toincubation, units should be inverted, and swirled or manipulated to ensure contact of the mediumwith all internal surfaces of the closure system before they are incubated. Process simulation units should beincubated for a minimum of 14 days unless supported by another qualified duration/method. The temperaturechosen should be based upon its ability to recover microorganisms normally found environmentally or inthe product bioburden. A single incubation temperature in the range of 20-35 癈 may be used. Data shouldbe available to show the suitability of the selected incubation temperature to support growth. The selectedtemperature should be controlled and monitored continuously throughout the incubation period.
在培养之前，灌装的单元要倒装、翻转或者其它操作来保证培养基与密封组件整个内表面接触。工艺模拟的培养基至少培养十四天，除非有其它确认过的时间或者方法。温度的选择基于温度要能使环境常规发现的微生物或产品生物负载的微生物能够复活。可以使用20-35℃范围内的单一培养温度。要有数据说明选择的温度能够支持生长。选择的温度要在培养期间持续控制盒监测。

嗨，真是不看不知道，一看吓一跳啊，可以从PDA的指南中看到，PDA其实并没有规定培养基灌装的温度一定要在两个不同温度下进行培养，如果有培养基促生长的数据，在20-35的温度范围内选择一个温度也是可以的。（汗，上帝保佑老板别看到，俺打的报告建的两个培养室啊）。
小版是打不死的小强，俺就不信俺错了，记得火星人也写过一篇类似的文章，引用的是PIC/S的指南，俺再看看去：
PIC/S PI 007-6 RECOMMENDATION ON THE VALIDATION OF ASEPTIC PROCESSES
2011年1月1日发布
5.3.1 It is generally accepted to incubate at 20-25°C for a minimum of 7 days followed immediately, or after a first reading, by incubation at 30-35°C for a total minimum incubation time of 14 days. Other incubation schedules should be based on supporting validation data.
通常在先在20~25°C下至少培养7天，然后在30-35°C的温度下总共培养至少14天是可以的。其他培养计划应当基于支持性的数据。
小版终于找到了先低温再高温的理论来源了，虽然PIC/S也没有禁止其他的培养条件，但是至少小版不会被老板扣那本来就不多的奖金了。
小版继续找啊找，终于又在箱底找到一个指南
Guidance Media Fills for Validation of Aseptic Preparations for Positron Emission Tomography (PET) Drugs 2012年4月，这个指南虽然不是直接针对药品的，但是也有一定的借鉴作用。C. What are the steps involved in a media fill? 下有一段描述。After the final product container is filled and ready for release, it should be incubated in a temperature-controlled incubator. Although USP <71> recommends incubation at 20o– 25oC for the aerobic growth medium, as a practical matter any controlled temperature between 20o and 35oC would work for media fills. However, the “controlled temperature” should be specified in your procedures and be maintained within a range that does not exceed ±2.5 ±2.5oCoC. The incubation period of a media fill should be no less than 14 days and the containers should be examined every 2 or 3 days. 从上面可以看出，FDA和PDA的观点基本一致，都是可以选择20-35度间的一个温度做为培养条件，当然前提条件是必须做了促生长的实验。


综合以上，我们可以得到结论：
1.培养基灌装的培养温度可以在进行完培养基的促生长实验后，选择一个20-35度的温度进行培养，但是培养箱的温度需要控制在 ±2.5oC.
2.对于培养温度的先后问题，目前除了PIC/S的指南外，没有其他指南明确了先后，先后顺序一样需要促生长实验的结果支持。

俺可以得到的教训是：
1. 师傅未必都是对的，还需要看教材到底怎么说的，当然一本教材也未必是对的，最好看原始的资料来源或者多看几本教材。
2. 人云亦云易，探索求真难，希望大家不仅仅是得到答案，在得到答案后，最好再去求个真。


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 小中大

高效检漏的各种方法



钠焰法 Sodium Flame
源于英国，中国通行，欧洲部分国家于20世纪70～90年代实行。
试验尘源为单分散相氯化钠盐雾。“量”为含盐雾时氢气火焰的亮度。主要仪器为光度计。
盐水在压缩空气的搅动下飞溅，经干燥形成微小盐雾并进入风道。在过滤器前后分别采样，含盐雾气样使氢气火焰的颜色变蓝、亮度增加。以火焰亮度来判断空气的盐雾浓度，并以此确定过滤器对盐雾的过滤效率。
国家标准规定的盐雾颗粒平均直径为0.4mm，但对国内现有装置的实测结果为0.5mm。欧洲对实际试验盐雾颗粒中径的测量结果为0.65mm。
随着扫描法的普及，欧洲已经不再使用钠焰法。国内有关部门正在修订原有的国家标准，是废止还是继续使用钠焰法，两种意见的都没有结论。
相关标准：英国BS3928-1969，欧洲Eurovent 4/4，中国GB6165-85。

DOP法
　　源于美国，国际通行，中国从未实行过。
试验尘源为0.3mm单分散相DOP（塑料工业常用增塑剂）液滴。“量”为含DOP空气的浑浊程度。测量粉尘的仪器为光度计（photometer）。以气样的浊度差别来判定过滤器对DOP颗粒的过滤效率。
对DOP液体加热成蒸汽，蒸汽在特定条件下冷凝成微小液滴，去掉过大和过小的液滴后留下0.3mm左右的颗粒，雾状DOP进入风道。测量过滤器前后气样的浊度，并由此判断过滤器对0.3mm 粉尘的过滤效率。
DOP法已经有50多年的历史，这种方法曾经是国际上测量高效过滤器最常用的方法。早期，人们认为过滤器对0.3mm的粉尘最难过滤，因此规定使用0.3mm粉尘测量高效过滤器。
DOP中含苯环，人们怀疑它致癌，因此许多实验室改用性能类似但不含苯环的替代物，如DOS，但试验方法仍称“DOP法”。
通过改变发尘参数，可以获得其它粒径的DOP液滴。于是就有20年前欧美国家测量超高效过滤器的0.1mm DOP法，有时测量仪器也改为凝结核激光粒子计数器。有些国外厂家曾标出对0.05mm或0.03mm DOP的过滤效率，那都是商业上无科学依据的标新立异。
测量高效过滤器的DOP法也称“热DOP法”。与此对应的“冷DOP”是指Laskin喷管（用压缩空气在液体中鼓气泡，飞溅产生雾态人工尘）产生的多分散项DOP粉尘，在对过滤器进行扫描测试时，人们经常使用冷DOP。
相关标准：美国军用标准MIL-STD-282。

计数扫描法
欧洲通用，美国类似，其他国家紧跟。目前国际上高效过滤器的主流试验方法。
主要测量仪器为大流量激光粒子计数器或凝结核计数器（CNC）。用计数器对过滤器的整个出风面进行扫描检验，计数器给出每一点粉尘的个数和粒径。这种方法不仅能测量过滤器的平均效率，还可以比较各点的局部效率。
欧洲人的经验表明，对于高效过滤器，最容易穿透的粉尘粒径在0.1～0.25mm之间的某一点，先确定测试条件最易穿透的粉尘粒径，然后连续扫描测量过滤器对该粒径粉尘的过滤效果，欧洲人将这种方法称为MPPS。美国标准干脆规定只测量0.1～0.2mm区间。
试验中使用的尘源为是Laskin喷管产生的多分散相液滴，或确定粒径的固体粉尘。有时，过滤器厂商要按照用户的特殊要求，使用大气粉尘或其它特定粉尘。若测试中使用的是凝结核计数器，就必须采用粒径已知的单分散相试验粉尘。
用计数器扫描一台过滤器需要较长时间。为了节省时间，国外将4组大流量采样头和激光测量装置合为一体，这使检测速度大大提高，但一台扫描台的检测速度仍赶不上一条普通过滤器生产线的生产速度，所以主流过滤器厂经常需要配置数台扫描装置。
计数扫描法是测试高效过滤器最严格的方法，用这种方法替代其它各种传统方法是大趋势。
相关标准：欧洲EN 1882.1～1882.5-1998～2000，美国IES-RP-CC007.1-1992。

光度计扫描
尘源一般为多分散相液滴，如Laskin喷管产生的DOP烟雾。使用光度计对过滤器的全平面进行扫描检漏。这种扫描方法能快速、准确地找到过滤器的漏点。由于尘源为多分散相，而光度计不能确定粉尘粒径，所以这种扫描法给出“过滤效率”没有什么实际意义。
有些厂家和用户认为，只要对滤纸的品质和规格严加控制，过滤器的效率就已经确定了，因此，仅进行以检漏为目的的扫描就可以保证过滤器的质量。
光度计扫描检漏的方法没有相应标准可依，但这种方法对生产过程的质量控制很有效，所用的测试设备又相对简单，因此有些厂家目前使用这种方法。光度扫描测试台很容易改成计数扫描台，花些钱将买台激光粒子计数器就可以了。

油雾法 Oil Mist
原西德，原苏联，中国。
尘源为油雾。“量”为含油雾空气的浊度。仪器为浊度计。以气样的浊度差别来判定过滤器对油雾颗粒的过滤效率。
德国规定用石蜡油，油雾粒径为0.3～0.5mm。中国标准规定的油雾平均重量直径为0.28～0.34mm，对油的种类未做具体规定。
油雾法在德国本土已经成为历史，德国于1993年率先搞出了计数扫描法的国家标准，欧洲标准EN1882就是以德国计数扫描法标准为蓝本制定的。
虽然中国标准规定可以用油雾法，但国内厂家更愿意使用同一标准规定的另一种钠焰法，只有部分生产滤材的厂家在测量过滤材料时仍使用油雾法。
相关标准：中国GB6165-85，德国DIN24184-1990。

荧光法 Uranine
只有法国使用，目前仅限于对部分核工业过滤器的测试。
试验尘源为喷雾器产生的荧光素钠粉尘。试验中，首先在过滤器前后采样，然后用水溶解采样滤纸上的荧光素钠，再测量含荧光素钠水溶液在特定条件下的荧光亮度，这一亮度间接地反映出粉尘的重量。以过滤器前后样品的荧光亮度差别来判断过滤器效率。
根据法国标准，发尘装置产生的粉尘粒径的计数平均值为0.08mm，粒径的体积平均值为0.15mm。
荧光法比较麻烦，测量时要先采样，再清洗试样，然后再到另一处去测量荧光。实际上，法国过滤器厂过去最常使用的是DOP法，而不是自己规定的荧光法，现在法国人又将欧洲标准化协会的计数扫描法定为国家标准，荧光法成了摆设。只有当涉到核级高效过滤器时，为了满足20年前传统客户的要求，他们才使用荧光法。
相关标准：法国NF X44-011-1972。

其它方法
变风量检漏。使用标准试验风道，如果降低风量后过滤器的效率降低，则肯定有漏点。在过去的高效过滤器试验方法标准中，经常出现变风量检漏的方法。变风量检查只能判断过滤器是否有漏点，不能对漏点定位。
发烟检漏。在暗室中，在过滤器上游发烟，用一束强光照射过滤器出风面，当过滤器有漏点时，可以明显地看到漏点处的一缕青烟。这种方法可以准确地对漏点定位，以便进行可能的修补。发烟检漏方法不那么讲究，但十分有效。
无污染检验。有些客户担心试验用的粉尘污染过滤器，过滤器制造厂不得不在测试时使用客户认为不污染过滤器的粉尘。例如，半导体芯片厂讨厌钠盐、油雾、DOP，他们经常要求制造厂家使用他们认为安全的固体颗粒粉尘；有些制药厂要求直接使用室外大气中的粉尘测量过滤器。
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生化药物生产过程中控制热原的方法



热原是微生物的代谢产物,是微生物的一种内毒素,其主要成分是脂多糖,分子量一般为106 左右。
去除热原的主要方法有:
1 高温法。多在250 ℃加热30 分钟以上。
2 酸碱法。用酸或碱进行处理,破坏热原。
3 吸附法。常用011 %～015 %的活性炭吸附处理。
4 层析法。利用离子交换树脂或分子筛凝胶层析处理。
5 超滤法。使用超滤装置滤除热原物质。
为了保证热原符合规定,往往要经过多次实验才能选择合适的方法,设计出适宜的工艺路线。在实际产品试制过程中,由于生化药物及基因工程药物多为核酸(核苷酸) 类和蛋白质(肽、氨基酸) 类物质,是微生物生长的优良培养基,控制热原成为一个生产难点。
控制热原可以从以下多个方面综合考虑:
1 　在生产全过程中注意控制热原的整体水平
避免在过程中受到微生物污染可避免引入过多的热原物质。所有的去除热原的方法都是基于热原物质在一定水平下,如果热原污染严重,处理起来就相当困难。
药品生产的GMP 管理,有效地加强了在生产全过程中对热原的控制。生产环境洁净度的控制、物料存放时温度的控制等,现在生产过程中已能严格执行,而对于时间的控制则往往忽视了。在洁净百级的环境下,环境温度一般要求在18～26 ℃,沉降菌允许3 个P皿(30 分钟) 。在此温度下,蛋白质、核酸类物质有利于微生物的繁殖,也就是说本已是无菌的原料或上一工序已无菌处理的物料,可能出现微生物的生长。因此根据长期的生产经验,要求物料(液) 在处理完毕后进行除菌过滤,而且从物料打开包装进行处理、配制到进行除菌过滤,时间宜控制在3 小时内,如处理后仍需冷藏的物料,则处理过程最好控制在2 小时内。
2 　用具处理
一般教科书中所提供的方法对于已洗干净的物品均是适用的。而对于已污染微生物或久置未用的用具则需给予特别注意。即在清洗过程中,先使用一定的化学方法进行除热原处理。如用洗液浸泡15 分钟以上或1 %氢氧化钠溶液煮沸15 分钟(建议
不使用碳酸钠) ,处理完毕后用无热原水进行清洗。
3 　选择去除原料、中间品中热原的方法
对于可能含有热原的原料或中间品,去除热原的方法受到多方面的限制。过酸、过碱、过热都会导致失活、降解、变性;吸附、超滤则导致含量损失、活性下降。常用的方法主要有凝胶过滤法、超滤法、吸附法。
3.1 　凝胶过滤法
对于处理量少的样品(如几十毫升) ,在实验室
条件下,该法较为适用。可根据分子量和化学性质
选择凝胶(如Sephadex G75) ,凝胶在装柱前煮沸灭菌或用稀酸、稀碱洗涤,配制洗脱液的盐可用高温法除去热原,配液用无热原水(溶剂) ,洗脱液容器的通气口用无菌脱脂棉封口,当用鲎试验法检查层析柱平衡液的流出液内毒素反应呈阴性时,方可进行凝
胶过滤,过程中温度宜控制在10 ℃以下,过滤时间控制在3 小时内,并根据过滤时间来确定柱体积与上样量。曾测试层析时间为4 小时的蛋白质类物质除热原,热原符合规定。
3.2 　超滤法
目前生产上已广泛使用超滤法去除热原,超滤膜截留孔径多选用7000～30000 分子量之间,效果较为令人满意。超滤装置与超滤膜的完整性是该法的关键。超滤前对样品进行预过滤以及超滤后即时进行清洗,可延长超滤膜的使用寿命。
对于组份复杂的蛋白质、肽类物质,超滤后,将发生一些变化。对于液态制成品,在贮存期内,可能会缓慢出现微量沉淀、白点、白块;对于固态制成品,则可能在溶解时存在微量不溶或白点、白块,从而导致澄明度不合格,这需在工艺中另行克服解决。可能的原因是:超滤前的物质的稳态系统,在超滤过程中部分物质被除去或是除去的比例不同,致使平衡破坏,造成另一部分物质析出而达到新的平衡。
超滤时还需注意的是pH。滤出液的pH 差值可能变化012 甚至015。另外,待超滤液的pH 不仅对超滤速度产生影响,还直接影响到产品收率、活性。
3.3 　吸附法
吸附剂以活性碳最为常用,且成本低廉。活性碳吸附处理热原时的关键在于控制pH 与温度。活性碳的用量为011 %～015 % ,一般不必超过014 % ,用量较大时可分次加入。在使用前,将活性碳在180 ℃烘烤2 小时,一方面使活性碳本身去除热原,另一方面也使得活性碳活化,提高吸附力,使一定工艺条件下吸附力稳定。
活性碳吸附处理时,料液的pH 应控制在酸性条件下,此时去除热原的效果比较理想。考虑到对产品性质的影响,一般选择pH510～615。如料液终
点pH > 615 ,在活性碳吸附处理前,先将pH 调到pH615 以下;吸附处理后,去除活性碳,然后再回调pH 至终点pH。如在去除活性碳前就回调pH 至终点pH ,则可能使已吸附的热原物质发生解吸附,从
而使热原不合格。
活性碳吸附处理时的料液温度对吸附效果影响也十分重要。如pH610、40 ℃吸附处理20 分钟热原不合格的核酸类料液,于pH610、80 ℃吸附处理20分钟,热原可符合规定。如果料液性质允许,吸附处理的温度可尽量提高,相应的可缩短处理时间;如不宜高温处理,则可降低吸附处理时的pH ,并适当延长吸附时间。
通过pH、温度与吸附时间、活性碳用量的相互配合,在除去的同时,可使含量损失控制在10 %以内。
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灭菌大法汇总



灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方法。本法适用于无菌、灭菌制剂、原料、辅料及医疗器械等生产过程中物品的灭菌。
无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。然而，对于任何一批灭菌产品来说，绝对无菌是既无法保证也无法被用试验来证实的，因为不可能对每一最小包装的产品进行无菌试验。事实上，物理或化学灭菌方法手段灭菌试验表明：微生物的杀灭曲线遵循对数规则，，因此，所以，批已灭菌物品的无菌性标准一般在概率意义上定义为污染单位低到可接受的程度，一般用以物品灭菌后微生物存活的概率-无菌保证值水平SAL (Sterility Assurance Level)表示。最终灭菌产品产品微生物存活的概率的无菌保证值一般不得低于高于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。无菌保证值与灭菌物品中存在的微生物数量及特性密切相关，因此在产品生产的各个环节均应采取各种有效的手段(包括过滤除菌等措施)来降低待灭菌产品的微生物污染并控制在规定的限度内。已灭菌产品达到的无菌保证水平可通过验证确定。
灭菌产品的无菌保证并不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的全面质量保证体系。灭菌工艺的制定确定应综合考虑其被灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性、和经济性及、灭菌后产品物品的完整性和稳定性等因素。
灭菌程序的验证是无菌保证的重要内容必要条件。对灭菌产品(包括最终容器及包装)而言，；灭菌方法在实际应用前必须对其灭菌程序经进行验证后，方可交付正式使用。验证内容包括：
⑴撰写确定验证方案及制定评估标准。
⑵确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确,并能处于正常运行（安装确认）。
⑶确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常工作运行（运行确认）。
⑷采用灭菌物品或模拟物品进行重复试验，提供各参数范围，确认灭菌效果符合规定（性能确认）。
⑸汇总并完善各种文件和记录，撰写记录完整的验证报告。
日常生产中，应对灭菌过程程序的运行情况进行监控，确认灭菌过程中各关键参数（如温度、压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照吸收剂量等）均在验证确定的范围内。；已采用的灭菌程序中关键的设备和工艺应定期进行再验证。当灭菌程序发生较大变化发生变更时，（包括灭菌柜中灭菌物品放置装载方式和数量发生的改变）时，应进行重新再验证。
产品在这种概率意义上的无菌保证并不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的全面质量保证体系。这意味着批生产过程的监控将比批无菌试验结果更能反映产品的无菌保证水平。产品的无菌保证与灭菌前产品被污染的程度及污染菌的特性相关。因此，应严格监控被灭菌品灭菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生产的各个环节采取各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。
否则，应采取必要手段降低污染及消除抗性菌株，甚至进行灭菌工艺的重新验证。灭菌后，应防止已灭菌物品被再次污染。任何情况下，都应要求容器及其密封系统确保产品在有效期内符合无菌要求。
灭 菌 方 法
常用的灭菌方法有蒸汽湿热灭菌法、干热灭菌法、气体灭菌法、辐射灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法的组合灭菌。只要产品允许，一般应尽可能选用终端最终灭菌法（即产品分装至包装容器后再灭菌）灭菌。若产品不适合采用终端最终灭菌法，可选用过滤除菌法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌的产品作补充性灭菌处理（如流通蒸汽灭菌）。
一、蒸汽湿热灭菌法
本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽或流通蒸汽灭菌、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。高压蒸汽灭菌该法灭菌能力强，为热力学灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他其它遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可用本法灭菌。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。1. 蒸汽灭菌的有关参数
(1)D值
D值即微生物的耐热参数，系指一定温度下，杀灭90%微生物所需的时间，以分表示。D值越大，表明该微生物的耐热性越强。不同的微生物在不同环境条件下具有不同的D值。
灭菌方法验证时，微生物的耐热参数一般使用D121℃ 。
(2)Z值
Z值即灭菌温度系数，系指使某一种微生物的D值下降一个对数单位，灭菌温度应升高的值(℃)，通常取10℃。它被用于定量的描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度，Z值越大孢子对温度的敏感性越弱。
(3)FT值
FT值系指给定的Z值下，灭菌程序所赋予待灭菌品在温度T下的灭菌时间，以分表示。
LgP=lgN0- FT/DT
式中P为灭菌产品中微生物存活的概率。
N0为产品灭菌前微生物的数量。
灭菌温度高时，FT值就小，灭菌温度较低时，所需FT值就大。
(4)灭菌率L
L值系指在某温度下灭菌1分钟所相应的标准灭菌时间(分)， 即F0和FT的比值(L= F0/FT = D121℃ /DT)。不同Z值、不同温度下的L值是不同的，灭菌率均可查得。
(5) F0值
F0值即标准灭菌时间，系指灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间，即T=121℃、Z=10℃时的FT值。121℃为标准状态，F0值即为标准灭菌时间，以分表示。一个灭菌程序的总的标准灭菌时间F0，应包括加热及冷却过程。它可以用灭菌率对时间求积分的方法计算而得。
F0=∫t2t1L·dt
式中dt为测定的间隔时间，相邻两次的间隔时间通常取1分钟。
100℃以下，L值可以忽略。F0是作为灭菌过程中监控物品达到无菌保证的重要手段。现代灭菌器上设置有F0值自动显示系统。
上述参数及其关系为蒸汽灭菌程序的设计、验证及日常灭菌效果的监控提供了理论依据。
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灭菌条件及验证的基本要求

高压蒸汽湿热灭菌条件一般通常采用121℃×20min或116℃×40min的程序，也可采用其它温度和时间参数。总之，必须保证物品灭菌后的SAL≤10-6。总之，必须验证所采用的灭菌条件能达到无菌保证要求。在实际应用中，对热稳定的产品或物品，可采用过度杀灭法菌，其SAL应≤10-1212。对热极为敏感的产品，可的允许标准灭菌时间F0可低于8min。，但对F0低于8的灭菌程序要求应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施防止耐热菌污染及降低微生物污染水平，以确保被灭菌灭菌产品达到无菌保证要求。灭菌物品的表面必须洁净，不得污染有机物质。必要时，外表应用适宜的包皮宽松的包裹，特别是烧瓶、试管等容器的塞子要防止脱落。灭菌柜内的物品装载方式应保证灭菌蒸汽彻底穿透物品，且不影响蒸汽穿透速度和灭菌后的干燥程度。灭菌柜中的空气应排空并被饱和蒸汽完全替代,以保证表压与灭菌柜内压力的一致。
采用湿热灭菌时[d1] ，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性。
蒸汽灭菌法湿热灭菌工艺验证时，应进行热分布试验、热穿透试验和生物指示剂验证试验。以确定灭菌柜空载及不同装载时腔室里中的热分布状况及可能存在的冷点；在空载条件下，确认121℃时腔室的各点的温度差值应≤±1℃、；使用插入实际物品或模拟物品内的温度探头，确认灭菌柜在不同装载时，最冷点物品的标准灭菌时间（F0）达到设定的标准；用生物指示剂进一步确认在不同装载时冷点处的灭菌物品达到无菌保证水平。本法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
二、干热灭菌法
本法系指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法，在干热灭菌柜、连续性干热灭菌系统或烘箱等设备中进行灭菌。可用适用于耐高温但不宜用蒸汽湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，也是最为有效的除热原方法之一，如玻璃器具、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。
干热灭菌条件一般为160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×45min以上，也可采用其它温度和时间参数。总之，应保证灭菌后的产品其SAL≤10-6。干热过度杀菌杀灭后产品的SAL应≤10-12，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。干热灭菌250℃ 45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。
采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性。
用本法灭菌的物品表面必须洁净，不得污染有机物质，必要时外面应用适宜的包皮宽松包裹。配有塞子的烧瓶、试管等容器口应有金属箔或纱布等包皮包裹，并用适宜的方式捆扎，防止脱落。干热灭菌箱内物品排列不可过密，保证热能均匀穿透全部物品。
干热灭菌法验证与蒸汽湿热灭菌法相同，应进行热分布试验、热穿透试验、生物指示剂验证试验或细菌内毒素灭活验证试验。以确认灭菌柜中的温度分布应符合设定的标准、确定最冷点位置、确认最冷点标准灭菌时间（FH）能保证达到设定标准并达到SAL要求。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin）。验证时，一般采用最大装载方式。
三、辐射灭菌法
本法系指将灭菌产品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的为60Co-γ射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等均可用本法灭菌。
采用辐射灭菌法灭菌的无菌产品其SAL应≤10-6。γ射线辐射灭菌所控的参数主要是辐射剂量（指灭菌物品的吸收剂量）。该剂量的制定应根据考虑产品灭菌物品的适应性和及产品可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，所使用的剂量事先应验证其有效性及安全性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭菌前，应对待被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。
灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时计量剂量计应用标准源进行校正，并定期进行再校正。
当60Co-γ辐射用于中药非灭菌制剂灭菌以控制其微生物污染水平时，一般最高辐射吸收剂量为：散剂及含原粉胶囊剂3 kGy、丸剂5 kGy、半成品粉末6 kGy。辐射灭菌后的物品，应进行微生物检测，同时应测定中药灭菌辐射前后的主要药效成分是否变化，以确定该方法的安全性和有效性。
60Co-γ射线辐射灭菌法验证时，除进行生物指示剂验证试验外，还应确认空载和装载时灭菌腔内的辐射剂量的分布图、灭菌物品的吸收剂量及最大和最小吸收剂量的分布、灭菌物品的均一性、灭菌腔内物品的装载方式等。常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。
四、气体灭菌法
本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。在充有灭菌气体的高压腔室内进行。常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等，本法适用于在气体中稳定的物品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。
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本法中最常用的气体是环氧乙烷，一般与80％～90％的惰性气体混合使用。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用。另外，使用气态过氧化氢和臭氧（O3）灭菌，因其无危害性残留物，不会对操作人员和环境造成危害，适合于空间和物品表面的灭菌。
采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因数。可采用下列灭菌条件：
温度 （ 54 ±10）℃
相对湿度 （60±10）%
灭菌压力 8×105Pa
灭菌时间 90min
灭菌条件应予验证。灭菌时，先将灭菌腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和其他易挥发性残渣消散。并对后通入环氧乙烷残留物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定浓度，避免产生毒性。
环氧乙烷灭菌法验证时，应进行如下试验：泄露泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性；生物指示剂的验证试验，指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)；灭菌后换气次数的验证试验，确认环氧乙烷及相应的反应产物含量在限定的范围内。验证设计时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中物品的排列方式对灭菌气体的扩散和渗透的影响。
五、过滤除菌法
本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去空气气体或液体中的微生物的方法。在开放式或封闭式过滤系统中进行。本法广泛用于制药行业，特别是常用于对热不稳定的药品溶液或原料的除菌。
除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清洗滤器，再更换滤膜。
过滤过程中无菌保证与过滤液体液体的初始生物负载负荷及过滤器的对数下降值LRV(Log Reduction Value)有关。LRV是表示系指在规定条件下，待被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。
即： LRV=lgN0- LgN
式中N0为产品除菌前的微生物数量。
N 为产品除菌后的微生物数量。
LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求每1cm2有效过滤面积的LRV应不小于7。因此过滤除菌时，应将待被过滤产品总的污染量应控制在规定的范围限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数（滤膜孔径的大小及分布，滤膜的完整性及LRV）进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验。测定滤器是否符合已验证过的完整性控制标准，确认滤膜在除菌过滤过程中的有效性和完整性。完整性试验可使用完整性试验仪测定。除菌过滤器的使用时间不应超过一个工作日，否则应进行验证。
过滤系统的验证包括过滤系统对过滤液体的适应性、过滤材料对溶液的污染程度、过滤器的规格、过滤器的灭菌方法、过滤系统的完整性试验、生物指示剂试验、过滤液体的微生物含量控制及过滤时间、过滤器的使用寿命等。上述试验大部分可由滤器的生产厂商来进行。微生物挑战性试验常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止再污染。
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六、无菌生产工艺
无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂（如粉针剂）的方法，无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤除菌法。
无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止被再次污染。
无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装摸拟试验验证，试验结果的阳性率不得超过0.1%(置信度取95%)。值不得低于3。因此在生产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的无菌性。
无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培养基模拟分灌装试验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特殊的活微生物制成的特殊制剂品。可用于确定确认灭菌设备的性能、灭菌物品的灭菌程序的建立和有效性的验证、灭菌程序的再验证、供评估产品灭菌是否达到无菌保证要求的依据、无菌空气过滤系统的评估生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。
选择制备生物指示剂用微生物的基本要求
不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：
(1) 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能被污染微生物的耐受性。
(2) 菌种应无致病性。
(3) 菌株应稳定。存活期长，易于保存。
(4) 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
1. 生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，应需先确定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）值等。
菌株应用适宜的培养基（如产孢子的培养基）进行培养。培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式，通常是将一定数量的孢子附着在无生命的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物指示剂应选用合适的材料包装进行包装以防止微生物的污染和孢子损耗，，并确定设定有效期。载体和内层包装材料在保护生物指示剂不被污染和损耗的同时，还应保证灭菌剂穿透必须保证灭菌因子易穿透包装内的微生物部位并能与生物指示剂充分接触、不得有任何污染物、在灭菌过程中不被破坏，否则将影响生物指示剂有效性、稳定性及使用。同时载体和包装应设计应原则是便于贮存、运输、取样、转移接种，并能避免这些过程微生物的污染和孢子的损耗。
有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。此时必须论证替代品对孢子的生长繁殖没有影响及孢子的耐受力没有降低。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
2. 生物指示剂的应用
在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性更好的最直观的指标。灭菌用的生物指示剂可来源于使用商品化市售的标准生物指示剂，或是也可使用由日常生产污染菌监控中分离的最耐受微生物制备的孢子并经实验室制备而得。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在终端最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜中灭菌因子最不易到达的部位（最冷点）的不同部位。若正常生产中需要用生物指示剂进行灭菌效果监测时，应注意放置方式并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。
过度杀菌杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用商品化市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量和、耐受力性、和灭菌程序验证所用的生物指示剂数量和耐受力及其他相关的参数获得的数据进行评估。
3.常用生物指示剂
(1)蒸汽湿热灭菌法：蒸汽湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子数5×105～5×106个，在121℃、19min下应被完全杀灭。另外此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
(2)干热灭菌法：干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数5×105～5×106个。去热原验证时使用大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000细菌内毒素单位。
(3) 辐射灭菌法：辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10 327、NCIMB 10 692、ATCC 27 142)。每片活孢子数107～108，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更大强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量的建立。
(4) 气体灭菌法：环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10 073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10 007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×106～5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
⑸ 过滤除菌法：过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta,如ATCC19 146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratin marcescens)(ATCC 14 756)，用于滤膜孔径为0.45μm的滤器 。
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冻干机在线灭菌新工艺



GMP（2010版）于2011年3月1日颁布实施，国家食品药品监督管理局要求所有注射剂企业必须于2013年12月31日通过GMP认证，药品生产企业尤其是注射剂生产企业将面临新一轮的考验。
  　　最近一段时间，“冻干机是否必须在线灭菌”这一问题被再一次提出。在GMP（1998版）的认证中就有过一次大讨论，专家们最后的意见是“鉴于国情，对冻干机的在线灭菌不作强制性要求，但企业应对冻干机的无菌进行充分验证”。因此，不具备在线灭菌功能的冻干机均通过GMP（1998版本）认证。世异时移，GMP（2010版）颁布了，您的理念不更新可能麻烦就来了。本着互相学习，共同进步的原则，就冻干机灭菌问题，谈谈本人的认识，不当之处欢迎批评指正。
1. 冻干机一定要在线灭菌吗？
  　　生产冻干粉针剂的真空冷冻干燥机一定要在线灭菌，而不仅仅是消毒。
  　　最近几年陆续有一些生产冻干粉针剂的企业通过了欧盟或FDA认证，冻干机具有在线灭菌功能，并且批与批之间进行灭菌，这是一项最基本的要求。中国GMP（2010版）与欧盟GMP的要求已基本一致，强调的都是“质量风险管理”，无庸置疑，对冻干机进行在线灭菌（而不仅仅是消毒）是通过GMP（2010版）认证的最基本条件。
  　　中国药典（2010版）附录——灭菌法：无菌分装及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺，相关的设备、包装容器、塞子及其它物品应采用适当的方法进行灭菌，并防止被再次污染。
  　　冻干粉针剂生产过程中从药液的除菌过滤到轧盖完成，药品在生产环境中暴露时间长达30-50小时，其中约30小时都在冻干箱中，为了保证产品的无菌，因此需要把冻干箱（干燥箱、冷肼、相关管道）作为一个无菌空间来管理。
2. 为何GMP（2010版）对“无菌药品”部份进行大幅度的修改？
  　　从事过无菌药品的同行应该都知道，GMP（1998版）太过落后，企业执行过程中，无菌风险无法控制，国家局不得不提出“万级”与“无菌万级”的概念进行过渡。GMP（2010版）对“无菌药品”进行大幅修订使其内容与欧盟GMP基本一致。
  　　大幅提升要求的主要原因有三：①安全用药的需要：无菌药品的给药方式一般是透过人体自我保护屏障，采用注射或输液的方式直接进入血液或组织，作用迅速，因此药品质量的问题将迅速威胁到病人的生命。②提高竞争的需要：中国加入世贸，参与全球竞争，需要高质量的药品，不少具备实力的企业已率先通过欧盟或FDA认证。③人民用药的需要：国内制药企业小而散，懂药与不懂药的都扎堆于制药业，低水平重复建设，最终导致恶性竞争，产品质量受到影响。近几年国内药害事件频发，国民反响激烈，向国际标准看齐势在必行。抱怨“国际标准，国内价格”已没有任何实质意义。
3. 国内生产冻干粉针剂的冻干机装配水平如何？
  　　某冻干机制造企业曾对国内生产冻干粉针剂的药企调查统计数据显示：目前国内在用冻干机只有10%配置了在线蒸汽灭菌（SIP）系统。
  　　10%配置SIP装置的冻干机，也没有完全发挥其功用。在生产中也没有做到批与批之间进行灭菌，有的药企一周（或一月）灭菌一次，有的药企甚至将SIP系统成了摆设，仅在GMP认证时展示给认证专家看。主要由于SIP系统自动化程度高，故障率相应较高，灭菌周期长等原因，另外90%的冻干机均未配置SIP系统，在生产中只是采用消毒剂进行处理。其中大部份使用75%酒精，也有采用臭氧甚至甲醛处理的。
也正是考虑到上述“国情”，才有了前文中“专家们的最后意见”。
4.为什么大部份药企未采用配置在线灭菌的冻干机？
  　　造成目前局面有下列原因：①国内买不到：由于技术原因，我国在1998年以前基本上生产不出具备SIP功能的冻干机，少数几家财力雄厚的生化药厂只能选择国外冻干机。1998年以后，以东富龙公司为代表的冻干设备生产企业才能生产出具备SIP功能的冻干机。②质量风险意识低：中国药企普遍存在基础较差，质量风险意识较低，在执行GMP时注重“符合性”，且GMP认证检查员考虑到“国情”，让未配置在线灭菌冻干机的企业均通过GMP（1998版）认证。于是药企普遍有这样的认识：“既然只进行冻干箱消毒就能通过GMP认证，说明是“符合GMP要求”的，那又何必花大价钱去购买配置在线灭菌装置的冻干机呢？”。③设备价格高：配置SIP系统的冻干机价格比普通冻干机贵了将近一倍，使用、维护费用也相对提高。④灭菌周期长：一般进行在线蒸汽灭菌周期8-10小时，致使生产周期延长，对于生产量大，产品附加值低的药企，肯定不乐意。
5.配置SIP系统的冻干机与普通冻干机的差异在哪里？
  　　首先配置SIP系统冻干机的干燥箱体和真空冷凝器属于D类压力容器，其箱体和冷肼在设计和制作上也要比普通冻干机复杂得多，例如：干燥腔室不能使用有机玻璃或普通玻璃观察窗，箱门应使用不锈钢耐压门窗。
其次在线蒸汽灭菌装置由安全阀、电接点压力表、压力变送器、蒸汽总阀、前箱进水进汽阀、后箱进水进汽阀、前箱排水排汽阀、后箱排水排汽阀、总排阀、间排阀、疏水阀、水环泵、进水阀等部门集成。装置复杂，自动化程度高，系统制造成本高，售价也高。相应地维修护成本也高。
  　　另外由于是D类压力容器，应按“压力容器管理规范”在当地质量技术监督管理部门备案后才能使用，每年应检测维护，交纳相关费用，并且在使用一定期限后应报废处理。
6.消毒与灭菌有什么不同？
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发表于 2015-3-11 21:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

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消毒与灭菌是两个完全不同的概念。
  　　“消毒”是指用化学性试剂杀灭致病微生物的过程。消毒剂能使致病微生物数量下降，但不能杀灭孢子和所有的微生物。
  　　“灭菌”即用物理或化学手段将物体中活的微生物杀灭或除去，从而使物品中残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的过程。最终灭菌的物品微生物存活概率即无菌保证水平（SAL）不得高于10-6。常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤除菌法。
7.冻干机的在线灭菌方法有哪些？
  　　目前冻干机的在线灭菌方法有蒸汽灭菌、环氧乙烷灭菌、气化双氧水灭菌(VHP)等方法。其作用均为对干燥箱、真空冷凝器、相关管道的内表面灭菌，创造一个适于药品生产的无菌环境，避免冷冻干燥过程中对药品造成微生物污染的风险。上述三种方法均为药典推荐的灭菌方法，其中环氧乙烷由于高压、易燃、易爆、有毒，已基本不在冻干机中应用。
  　　蒸汽灭菌、气化双氧水灭菌（VHP）都能确保最终灭菌的物品微生物存活概率即无菌保证水平（SAL）不高于10-6。
8.冻干机采用蒸汽灭菌的优缺点是什么？
  　　目前上市的冻干机普遍配置有SIP系统，采用纯蒸汽灭菌。其优缺点：① 蒸汽灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法， FDA确认过程没有任何疑义的灭菌方法。重现性好，无污染，可用生物指示剂验证。②蒸汽灭菌使腔室内有很大的压差变化，长期反复的受压、抽真空，缩短设备寿命，同时可能会产生干燥箱、冷凝器的密封件部位的泄漏，而影响冻干制品的质量。③干燥腔室内部构件一般由不锈钢材料制造，应避免蒸汽灭菌对不锈钢构件的腐蚀、干燥箱内表面生锈，生锈大多数情况下由高温腐蚀所引起，其主要机理是氯离子对不锈钢材料的晶间腐蚀，特别是含有氯化物溶液的高温、高压、湿热环境对不锈钢表面钝化膜的破坏非常大，而不锈钢的耐腐蚀性主要依靠这层微薄的钝化膜，因此干燥箱体不锈钢应采用316L超低碳钢，该钢具有较强抗晶间腐蚀通能力。④蒸汽灭菌周期8-10小时，消毒周期长。
9.冻干机采用环氧乙烷灭菌的优缺点是什么？
  　　在SIP系统还不成熟时，有些冻干机采用环氧乙烷灭菌，但目前已基本淘汰不用。其优缺点：① 环氧乙烷灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法，可用生物指示剂验证。②环氧乙烷有毒，灭菌过程中，应注意残余废气中环氧乙烷的含量是否符合药品生产卫生要求。人员应注意保护，吸入过量可引直头痛、恶心、呕吐，严重者可引起水肿。环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，因此使用环氧乙烷应特别注意安全。③采用环氧乙烷灭菌时，一般在高压腔室内进行。灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间是影响灭菌效果的重要因素。药典推荐的灭菌条件：温度54℃±10℃，相对湿度60%±10%，灭菌压力8*105pa，灭菌时间90min。④灭菌效果随外界环境条件、腔体内微小水滴会出现较大的差异；较难彻底地清除冻干机内残留物。⑤环氧乙烷会对冻干机有腐蚀作用，对箱门密封条、真空隔离密封条、传感器导线的绝缘层、箱体产生腐蚀作用。⑥环氧乙烷灭菌周期为12-18小时，较蒸汽灭菌周期更长。
10.冻干机采用汽化过氧化氢灭菌的优缺点是什么？
  　　汽化过氧化氢（VHP）灭菌方法是美国灭菌公司（American sterlizger co,简称AMS CO）研究发明的，在医疗器械、生物培养箱、生物安全柜、冻干机的灭菌已非常普遍，工艺已经非常成熟。其优缺点：①汽化过氧化氢灭菌法是各国药典、GMP、消毒灭菌技术规范推荐的方法，灭菌工艺重复性好，可用生物指示剂验证。②安全性高：该方法灭菌过程在常温、常压下运行，冻干机的干燥箱、冷肼无需按D类压力容器设计。③运行费用低：该方法每个灭菌循环双氧水耗用量极少，以15m2冻干机为例，每批运行成本汽化过氧化氢方式是纯蒸汽方式的10%。④配套费用低：采用汽化过氧化氢灭菌的冻干机的初装费用低于蒸汽灭菌冻干机30-50万。如果采用可移动式VHP发生器，可以对多台冻干机配套灭菌，则设备费用将成倍下降。无需纯蒸汽系统的长期配置，无需纯蒸汽的长期供应。⑤灭菌周期短：如果纯蒸汽消毒周期为8-10hr，环氧乙烷灭菌周期为12-18小时，则气化双氧水灭菌周期只有5-7hr。⑥无害无污染：由于气化过氧化氢灭菌的最终残余物为水和氧气，没有环氧乙烷、甲醛等的毒性和致癌作用，因此对环境、操作人员无害。⑦对设备无损害：蒸汽灭菌使灭菌腔室内有很大的压差变化，经常处于受压→真空状态，湿热气体易破坏冻干机腔体内表面不锈钢的钝化膜，缩短设备寿命。汽化过氧化氢灭菌由于压力、温度条件的改善，使冻干机的运行寿命和维修周期延长。⑧汽化过氧化氢灭菌要求所有灭菌表面必须干燥，各区域温度保持均衡。否则灭菌效果腔体内微小水滴或冰渣会出现较大的差异。
11.现用的冻干机未配置在线灭菌装置怎么办？
  　　建议您依据公司具体情况在下列方案中选择一种：
①汰旧更新：目前国内药企有90%冻干机无SIP功能，不少厂家已迅速行动，纷纷汰旧更新，能生产SIP的药机厂生意红火。如果您公司效益特别好，冻干机已使用多年，故障率高，不如淘汰旧机，订购新机，现在国内已有多家药机厂均可生产配置SIP的冻干机，技术已经比较成熟，10m2配SIP系统的冻干机大约300万左右。
②加装SIP：如果您出于多方面考虑不想淘汰旧冻干机，且旧冻干机是按压力容器制造，可将冻干机加装在线纯蒸汽灭菌系统。
③加装VHP：如果您不想淘汰旧冻干机，且旧冻干机又不是按压力容器制造，建议加装气化过氧化氢（VHP）在线灭菌装置，同样能达到对冻干机在线灭菌，无菌保证水平SAL≤10-6。选择加装VHP将有“适当改造”与“零改造”两种方案可选，具体在后面详述。
12.将冻干机加装在线蒸汽灭菌系统（SIP）需要确认的工作有哪些？
  　　将冻干机加装在线纯蒸汽灭菌系统是冻干机改造的首选方法，也是公认无异议的冻干机灭菌方法。但改造前须确认下列条件是否达到：①该冻干机制造时是按压力容器设计的，并有压力容器设计检测证书和备案证书。②该冻干机的换热系统（即导热油循环系统的所有装置）必须是按使用硅油作为导热油设计。③纯蒸汽系统供应能保证。
  　　如果上述条件能达到，那么该机可以通过加装SIP系统达到GMP要求。您最好与该机原生产厂家（有压力容器设计制造资格证）联系进行改造，每台冻干机的改造费用一般为100万元左右，时间一般为2个月左右。如果想联系原厂家以外的其它厂家，应特别注意是否有压力容器证书、自动控制系统的兼容性。
  　　如果上述条件的任意一项达不到，则您千万不能善自加装SIP系统。原因是：①配置SIP系统冻干机的干燥箱体和真空冷凝器属于D类压力容器，其箱体和冷肼在设计和制作上也要比普通冻干机复杂得多。自行将普通设备改造成压力容器，违法《压力容器管理条例》，是违法行为，一旦出事故会追究法律责任的，广东已有在蒸汽灭菌过程发生爆炸致人伤亡、洁净厂房垮塌的血的教训。②配置SIP系统的冻干机在设计制造时是使用硅油作导热油的，而普通冻干箱是采用4-4-2三元混合液或其它液体作导热油，二种导热油的沸点、凝固点、导热系数、运动粘度、比热、导热系数、密度、传热效率不一样，因此换热器面积、板层面积、循环泵等配置均不一样，如果仅仅只是更换导热油，可能出现冻干曲线难以控制、冻干失败或生产周期延长等情况。③冻干机进行纯蒸汽灭菌时消耗的蒸汽量较大（具体数量可参照蒸汽灭菌柜折算），在脉动及升温阶段，纯蒸汽供应得到保证，否则将进一步延长灭菌周期，并打乱原用汽计划或生产计划。
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