样品前处理

很老的帖子了，但写的不错，忍不住转载。有些图缺失

            生物样品前处理进展


作者：张玉峰

摘要：生物样品处理是建立分析方法的重要环节，其好坏直接关系到结果的好坏；虽然最新的分析仪器对样
品处理的要求降低了（例如API 4000），但对大部分实验室来说，干净的样品处理还是必须的。本文综述了
近五年来生物样品处理的最新进展，主要包括各种新型吸附剂的出现和多种在线装置的联用，其目的主要是
为了实现样品的高通量分析。最后对生物样品处理的前景进行了展望。

关键词：生物样品，固相萃取，固相微萃取，吸附剂，在线联用

简介
色谱、电泳和质谱等分离技术非常适合于分析复杂的多组分样品。然而，分析存在于血浆、血清、全血、组
织匀浆、唾液和尿中的样品时，需要精心设计样品的预处理过程。在使用反相色谱法的早期，有人尝试把未
处理的样品直接注进HPLC柱[1]。他们很快认识到，这种方法导致色谱柱分离能力很快下降、柱压升高、柱
寿命缩短；另外，吸附剂的选择性也由于不可逆的蛋白吸附而改变。
因此，需要合适的前处理方法除去内源性物质的干扰。样品前处理的方法包括（但不局限于）沉淀蛋白、液
液萃取、固液萃取和膜方法等。在这些方法中，SPE得到了广泛的接受，这是因为它有以下优点：易于实现
自动化；样品回收率高；提取重现性好；能选择性的提高目标分析物的浓度；有各种商品化的SPE装置和吸
附剂。传统的吸附剂主要以硅胶为材料，近10年来相继出现了一些新型的吸附剂。它们具有容量高、疏水性
好、选择性好，在反相条件下对亲水性物质保留时间长等优点。另外，采用了各种新的模式来加速和简化
SPE处理的过程，同时提高样品的通量、回收率和提取重现性。96孔并行处理SPE装置使样品的处理速度大
大提高，还有384孔的SPE装置，其更适于高通量分析。固相微萃取是近5年发展起来的处理挥发和半挥发样
品的新方法，它不需有机溶剂，样品用量少，适于痕量物质的分析。各种SPE于色谱和光谱在线联用的技术
提高了样品处理和分析的自动化程度。
本综述由两部分组成，首先介绍了各种SPE吸附剂的作用原理、应用及优缺点；接下来是当今流行的与SPE
有关的装置的简介，重点介绍了SPME.

1、 SPE吸附剂
1、 1 化学键合反相硅胶
自从1978年Sep-Pak小柱上市以来，C18反相吸附剂已成为最广泛使用的吸附剂。常见的SPE C18和C8硅胶吸
附剂见表1。

SPEC18硅胶在提取非极性和中等极性的化合物时，回收率较高，而对极性物质的回收率很小。另外，烷基
硅胶不能使用过酸或过碱的溶液；若需定量回收，需较大的洗脱体积；由于硅胶上有残留的硅醇基，使碱性
物质的回收率低；SPE C18在使用前需用与水混溶的有机溶剂活化，在使用过程中溶剂不能跑干，否则键合
相对被分析物的吸附力急剧下降，使样品的回收率很低。这些缺点促进了新一代聚合物SPE吸附剂的发展。

1、 2 非极性苯乙烯-二乙烯苯聚合物（PS-DVB）吸附剂

人们早就知道PS-DVB树脂比C18硅胶对极性大的物质的吸附力更强。但由于其在使用前需纯化，过程繁琐，所以当时没有商品化的预装小柱。最先商品化的可抛弃型PS-DVB小柱是LC级的PRP-1和PLRP-S。接着离线SPE装置的提取盘中也使用了PS-DVB吸附剂。PS-DVB的一个优点是能在pH 1~14范围内稳定。近来经过化学修饰的聚合物树脂也上市了，其中经乙酰基修饰的PS-DVB对醇类化合物的回收率较高。

反相硅胶和聚合物树脂的一个共同缺点是必须用润湿剂平衡，并且在分析前保持湿润。现在，市场上有两种
专利吸附剂克服了此缺点。据称，它们都是通用型的吸附剂，因为它们能提取不管是极性还是非极性的酸
性、碱性和中性化合物。一个是所谓的亲水-亲油平衡吸附剂，即Waters的Oasis HLB。它是二乙烯苯和N-乙烯吡咯酮的共聚物。用这种聚合物装的小柱对一些药物的Kw值比C18硅胶提高了许多。例如Catechol的lg Kw值为2.5而它在硅胶上的值为1.1。这是因为这种共聚物的表面积很大达800 m2/g，并且聚合物中的吡咯酮基团能接受氢原子。第二种专利吸附剂是Varian的Abselut Nexus，组成为methacrylic seter-based polymeric树脂和polystrene树脂按一定比例的混合物，表面积在500~650 m2/g范围内。根据制造商提供的数据，生物体液样品可以直接加在不需平衡的Abselut Nexus小柱上，因而简化了分析过程，节约了分析时间。

文献中已有使用Oasis HLB SPE柱从血浆中提取四环素类药物的报道[3]，即使在小柱跑干的情况下，血清中
四环素类抗生素的回收率仍很高，重现性也很好。因此这种吸附剂适合于96孔SPE装置，当96个样品同时处
理时很难保证有些孔内的吸附剂不跑干。

1、 3 免疫亲和吸附剂
免疫亲合固相萃取吸附剂，即所谓的免疫吸附剂，原理基于抗体的分子识别。由于抗原-抗体反应的高度亲
和性和高选择性，其在复杂生物样品的分析中具有独特的优点，即使样品的体积很大。免疫吸附剂还可以吸
附与目标分子结构相似的一类化合物，因此可以用来萃取体液中某一成分及其代谢物。典型的免疫萃取程序
如下：

免疫吸附剂的主要缺点是制备、分离和储存抗体很困难，其高度的特异性亲和限制了其通用性，很难实现广
泛商品化，并不适用于大部分实验室。但也有使用混合抗体来提高其通用性的研究。
1、 4 分子印记聚合物
在分子识别吸附剂领域中一个新的方向是合成分子印记聚合物（MIPs）。分子印记技术是指使目标分子与
高分子基质形成共聚物，然后用化学方法使目标分子脱离高分子基质，在分子水平上使基质表面形成一个个
空腔，从而对目标分子有很强选择性，其机理类似于抗原对抗体的特异识别[6]。原理如图所示[4]：

MIPs已成功的用来分析氨基酸、肽类和蛋白质，提取药物等[4]。MIPs在正相条件下表现出高选择性，然而
在极性溶剂中，吸附剂与目标分子的选择作用（氢键作用等）被溶剂的极性给压制了。今后的方向是如何解
决其在反相条件下的选择性问题。

1、 5 限制进入型吸附剂（RAM）
限制进入材料（RAM）一般以硅胶为载体，在其外表面键合着亲水性的二醇基。吸附剂外表面的空隙为约6
nm，只允许分子量小于15,000的进入。在进行样品萃取时，蛋白质等大分子不能进入载体内部并受到载体表面二醇基的排斥，因而不被保留；小分子药物可以进入载体内部与里面的非极性基团相互作用，发生反相吸附

生物样品可以直接注入RAM小柱，并可反复使用，因此实现了样品处理和分析的完全自动化。其与
HPLC联用的装置见图3：



1、 6 以碳为基质的吸附剂

最广泛使用的SPE碳载体是石墨碳黑（GCBs）.GCBs是石墨在高温（2700~3000℃）下加热得到的，在其表面有许多含氧功能基团，对极性物质吸附较强。最先商品化的GCBs是非多孔性的，表面积小。例如
Carbopack B。Carbopack 4的表面积为210 m2/g，在环境分析中应用很广，检测限可达5 ng/L。GCBs不耐压，不能应用于HPLC系统。

多孔石墨碳（PGC）是又一种新型的碳吸附剂，基性质类似于上世纪80年代末出现的LC级的Hypercarb。
PGC的结构高度均匀有序，表面积约120 m2/g。由于PGC的晶体结构是由范德华力结合起来的石墨片构成，往往其对相同物质的保留作用比C18硅胶强，但其保留机制完全不同于C18硅胶或PS-DVB聚合物[7]。PGC主要是通过疏水作用和电相互作用与溶液中的组分发生作用，因此不仅非极性组分能被保留，而且极性很大的水溶性组分也能被保留。例如吗啡和其代谢物在PGC小柱上的保留作用都很强[8]。在使用PGC吸附剂中常遇到的问题是如何洗脱被分析物，由于保留机制不同，乙腈和甲醇也可能不起效[9]，有时也使用二氯甲烷和四氢呋喃洗脱。文献中有使用倒冲的办法进行洗脱的方法，可适用于LC色谱柱，在SPE小柱上却行不通。

[ 本帖最后由 pharmasy1 于 2007-8-22 13:54 编辑 ]

2、 SPE的在线装置

SPE自动化的目的是为了提高样品的通量和方法的可靠性，主要通过两种方式实现：第一种是操作者预先编
好程序，准备好合适的缓冲液和cartridge，然后由机器人实现整个样品处理和分析的全过程。一般典型的系
统都包括一个自动进样器，可把提取后的样品直接注入HPLC(CE,MS)系统。现在商品化的仪器主要有：
Microlab SPE( Hamilton, Reno, NV,USA), Prospekt 2( Spark Holland, Emmen, The Netherlands)和ASPEC XL(Gilson, Middleton, WI, USA)。这些系统属于at-line自动化。

第二种自动化的方法与柱切换相同，其在使用一个标准的HPLC系统的同时还需要一个额外的泵和一个或多
个阀。样品通过自动进样器加在一个经过改造的SPE cartridge上，第二个泵把cartridge上的污物冲入废液
缸；接着，转动切换阀，留在cartridge上的成分被第一个泵冲入HPLC柱。装置的示意图见图4：

柱切换相对于at-line SPE方法有许多优点。因为这种系统可由传统的自动进样器改造而来，不用多少投入就
可以实现自动化。前柱可以重复使用降低了分析的成本，最重要的是on-line SPE提高了分析方法的灵敏度。
在at-line时，仅有一小部分固相萃取液被HPLC分析[10]，而on-line SPE的理论回收率是100%[11]。在使用MS检测时，检测线一般在 ng/mL或更低[12]。
On-line SPE方法的主要缺点是SPE cartridge的寿命很短，在进行蛋白质含量较高的生物样品分析时，根据进样量的不同一般每个小柱可进50~100个样品[13]。

3、 固相微萃取装置（SPME）

固相微萃取最先用来进行环境中的有机物分析，这种新的提取技术在食品、生化和药物领域受到了广泛的关
注。SPME有许多优点，例如简单、便宜、与分析系统兼容、易于自动化和不需提取溶剂等。SPME很易与
GC直接联用，其界面见图5：


在过去的几年里，也出现了SPME与HPLC和CE的联用装置，其可用来分析尿、血浆和头发等生物样品
[14]。与LC联用装置见图6[14]：
Fig 6 Diagram of the in-tube SPME-LC interface 。 The sample is frequently aspirated in the SPME capillary anddispensed back to its vial by movement of the syringe(valve in INJECT position). The six-port valve is switched to LOAD and methanol is pushed into the SPME capillary. The eluate is transferred to the loop, the valve is INJECT and subsequently directed by the LC elution solvent towards the analytical column.

SPME特别适于分析挥发和半挥发性成分，却不适于复杂基质（例如血浆或细胞组织中的蛋白）中的低挥发
性成分的分析。对于低挥发性组分来说，SPME比SPE和LLE的提取慢、回收率低；另一个缺点是当生物样
品中目标物质的浓度很低时，SPME提取会带入很多内源性物质，干扰样品的测定。因此血浆中的药物浓度
只有在1~100 μg/mL时才能被测定，这大大限制了其在药物动力学和TDM中的应用。


4、 结论与展望

现代分析的发展趋势受到了市场和技术的双重驱动，人类基因组测序和组合化学产生的成百上千的化合物使
分析化学进入了一个新的时代，很明显分析化学领域需要能提高样品通量的工具来迎接时代的挑战。
在过去十几年里，分析仪器方面的三个里程碑是HPLC-MS的广泛使用；MALDI-TOF-MS被用来分析生物高
分子；用毛细管电泳进行高通量DNA测序。
质谱的使用者已由过去的物理学家转变为现在的分析化学家，相应的MS制造商正在设计体积小、容易操作
的仪器，最新的MS已可以放在桌面上。这意味着HPLC系统将仅是MS的一个接口，而不再是分离的工具。
这样HPLC和SPE在高通量分析中的区别也就不明显了。
自动化的SPE装置将继续活跃的发展，商品化的384孔和1536孔的SPE盘，不久将会出现。
在一个芯片上的全分析系统的出现意味着将来的样品处理将整合在这种装置上，虽然现在这种整合的益处还
不明显。

好贴，要顶

不错，呵呵

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不错，谢谢分享！

我正要做ASE样品的处理呢，好像这是一种新技术

不错让我们了解了生物样品前处理的全景

不错，很全面的资料！！

ASE样品的处理， 是一种新技术