液相色谱

在做方法验证时对一些问题不太很清楚，指导原则上也是模棱两可，在此和大家讨论一下，请大家多指点，谢谢！
1、耐用性：有没有规定具体要做几种色谱条件，还是从流速、柱温、比例、pH等条件中随便选几个条件就可以了。
                       换色谱柱的话，流动相条件需要考察几个？换几根柱子？
                       采用什么样品做？（供试品溶液or系统适用性溶液or others？）
                       如何评价耐用性结果？（分离度是否合格？杂质种类有无变化？杂质含量有无变化？如果要考察杂质含量的话，是不是也要按外标法或     
                       自身对照来做，工作量会不会太大了）
2、LOD、LOQ采用什么样品做？对照品or供试品？
3、回收率：加样回收率能否向空白中加80%、100%、120%的已知纯度的原料药来做？对照品太贵了。
4、中控液相方法验证着重于什么？因为中控方法主要用归一化定量，对于方法的线性、准确度是否有必要验证？
请大家各抒己见！

3、回收率：应该可以用原料药做的，用对照品需要的量太大，也太贵了，用已知纯度的原料药就可以说明问题的，可以使用的

谢谢楼上的解答！

　　发布日期 20060120

　　栏目 化药药物评价

　　标题 含量测定分析方法验证的可接受标准简介

　　正文 审评四部 黄晓龙

　　摘要：本文介绍了在对含量测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

　　关键词：含量测定 分析方法验证 可接收标准

　　在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。

　　1.准确度

　　该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80%、100%和120%的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

　　可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差(RSD)应不大于2.0%。

　　2.线性

　　线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：

　　在80%至120%的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。

　　可接受的标准为：回归线的相关系数(R)不得小于0.998，Y轴截距应在100%响应值的2%以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。

　　3.精密度

　　1)重复性

　　配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

　　2)中间精密度

　　配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。

　　4.专属性

　　可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。

　　5.检测限

　　主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

　　6.定量限

　　主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。

　　7.耐用性

　　分别考察流动相比例变化±5%、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20%时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离;各条件下的含量数据(n=6)的相对标准差应不大于2.0%。

　　8、系统适应性

　　配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。

耐用性，我们一般就做流速，pH，流动相比例，柱温。
对于色谱柱的考察，一般选1~2根柱子，
耐用性采用酸碱破坏最严重的样品做。（耐用性考察变化因素对主成分出峰的影响，主峰是否纯，改变色谱条件原有杂质或新增杂质对主成分的检测是否存在干扰等。）
LOD/LOQ采用准确度的R1溶液不断稀释后的SN来确定。
其他的不懂！

　　我也说几句吧。

　　1、耐用性最主要考察的是仪器系统的适用性。也就是说，在特定的分析方法(流速、柱温、比例、pH等项下)，需考察理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。

　　理论塔板数即柱效，若药典早有标准，符合即可，若无，一般为待测组分或内标物质的理论板数;

　　分离度需大于1.5，以评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，衡量色谱系统效能;

　　重现性，考察连续5次(至少)进样后，色谱系统响应值的重复性;

　　拖尾因子，用于评价色谱峰的对称性。

　　当然，分析方法对以上考察存在较大影响。所以，若已有特定的分析方法是最好的了，若无，则只能从单一的一根色谱柱开始，调试流动相、流速、梯度、缓冲液、pH等。达到较好的效果再考察该条件下，不同色谱柱对其影响。

　　不一定要用外标法来做，外标法工作量真的不少，可以用百分比发粗略估算，等差不多了，再用外标法验证。

　　2、LOD、LOQ一般采用对照做，若对照量不太多，也可以用样品做，影响不大。

　　3、回收率，楼上说得差不多了。

2、需要用对照品做
3、理论上不能用原料药代替对照品

1、耐用性一般考察色谱柱（2-3根），0.1个ＰＨ变化，可以用样品溶液做。分离度是否合格？杂质种类有无变化？杂质含量有无变化？都是考察内容，工作量再大也得做。

耐用性我觉得找几个不稳定的因素做一下就行了，有的样品pH值无影响就没必要做pH,但流速、温度和比例我都会做一下！换色谱柱也只是拿验证的初始方法进行对比，看看杂质的分离度够不够。我一般选两类柱子，一类改变固定相的，一类改变尺寸的。