小中大转载：讨论：有关物质的测定是否有意义
药品开发过程中必须控制药品的质量，而在质量标准的制定过程中经常会碰到有关物质检查的问题。有关物质检查考察药品特殊杂质和未知杂质的量。那么它的意义何在？网友richardxue 对此提出以下问题：
1.检测结果的可信性如何考察？检测波长如何确定？破坏性试验条件如何选择？
2.有关物质限度如何确定？检测方法如何确定（如归一化法、自身对照法）？
3.试验结果积分参数如何确定，采用自动积分方式还是手动积分方式？
doudou13 ：我个人认为检测结果的可信性不大，因为大多数有关物质的检测方法与含量测定的方法差不多或雷同，此等条件下，只有同系物或结构类似的杂质或降解产物有类似的响应，（一般采用不加校正因子的主成分自身对照法测定）。
我接触到的几个药物的有关物质的测定我认为都有一定的缺陷，其中的一个合成药物，两种主要原料中的一种无紫外吸收。另一种降解后的产物无紫外吸收，直接变成无机小分子了。再者，杂质等的特征吸收与主药不同，也能造成很大影响。当然还有其他因素，溶解性差异，提取率的问题，柱保留的问题....... ，所以我认为有关物质检测的可信性不大。
richardxue ：药品需要考察的有关物质是是对药效有影响或者是有药理毒性的杂质。如果混入的杂质没有毒性，也不影响药效，含量很少，我们一般是不会考察的。 有没有那位站友用DAD（或者PDA）检测器做有关物质限量检查，而且申报资料通过sfda的审查的？
Samlang ：有关物质检测波长一般首选主成分的最大吸收，但如中间体或降解产物在此波长无吸收或吸收很弱，则要选一个可以兼顾的波长。这种归一化测定结果本来就不准。 破坏性试验一般是用加热、光照、酸、碱、氧化等使样品降解，降解产物应和主成分能分开。 有关物质限度一般为单个杂质不超过0.5％，总杂质不超过1.0％，最好用自身对照法。积分方式最好是设置好参数，让仪器自动积分。
analywww ：Samlang的观点我不能同意，"有关物质检测波长一般首选主成分的最大吸收"我认为是大家已比较习惯的错误做法，目前多数研究者将含量测定的HPLC方法套用，但大家需明白，含量测定是针对主药，而有关物质测定是针对杂质，我认为正确的方法是对各杂质的光谱行为进行考察，再寻求一个适宜的波长，此波长处主药和各有关物质的E值近似，那么我们无论是用面积百分比法还是主成分自身对照法，我们的结果都会客观地反映杂质的实际含量。当然这就需要一台DAD检测器的支持。
richardxue ：大家用自身对照法做有关物质检查的时候，是不是先将对照溶液先自动积分，然后供试溶液积分采用其积分方法积分？一般情况下，积分参数设定不同，被识别的峰个数不同，得到的结果也就不同。不知道正确的积分方法应该是怎样的？
mrzou ：在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：
1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。
2．简单地套用含量测定的色谱条件。在HPLC法进行含量测定时，为提高方法的灵敏度，降低干扰，往往选用主成分的最大吸收波长作为检测波长。若套用含量测定的色谱条件，实际仍是以主药的最大吸收波长作为有关物质检测波长。
3．以样品进行破坏性试验（酸、碱、热、光照、氧化等）后的溶液做紫外扫描，将扫描图谱中最大吸收波长确定为有关物质的检测波长。因破坏性试验后溶液中存在尚未破坏的主药、降解产物、辅料等，此溶液的紫外吸收为各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解产物的紫外吸收特性。由于未破坏主药所占比例较大，故破坏性试验后溶液的最大吸收波长一般仍为主药的最大吸收波长。
采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质，其前提之一是需检查的杂质与主成分在确定的检测波长下应有相近的紫外吸收（响应值接近），选择检测波长时需对产品中可能存在的杂质（合成原料、中间体、副产物以及降解产物）的紫外吸收特性进行研究。已知杂质的紫外吸收特性可采用对其流动相溶液直接进行扫描的方法考察，未知杂质（如未知降解产物等）可通过二极管阵列检测器考察其紫外吸收情况，根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检测波长。若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长，可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。只有经试验研究确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。
另外，HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的限度（一般不超过0.5%）控制。对于具有明确归属的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。对于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定，并制定严格的限度。
武富祥 ：有关物质的测定有没有意义，得具体问题具体对待，在平时的试验中，我们如果所测的东西是一个没有紫外特征吸收的东西，那么，用HPLC-UV法测本身就不可信，此时用TLC或其他适宜方法更合理。我也同意楼上同志所说的杂质测定的目标是杂质，而不是主药，但我认为药物的合成本身就是一定程度上的结构相似（在此偶的意思有点类似苯上加甲基成甲苯），其紫外吸收类似，所以也不能说用主成分的最大吸收波长检测没有道理。更何况，DAD虽然有用，但若用杂质的最大吸收，也不能反应物质的本来面目，再说杂质的吸收系数DAD也是无能为力的。所以我们还是与含量测定方法相同，虽然不能十分准确反应产品的质量，但质量标准不单单是用有关物质来控制的，况且我们在进行研究时对反应的中间体及酸碱热光等一些比较极端的条件进行验证，能够分离才用的，所以如果说有关物质的方法与含量测定方法相同，倒不如含量测定方法与有关物质测定法相同，再说，降解产物也不是一个分子的完全分解，仅是少数键的断裂或组合，生成新的化合物其紫外与主成分还是有一定的相似性的，所以在不能拿到杂质对照品的情况下，与含测定方法相同也不失为一个较为合理的方法。当然，开始说的情况例外。
geneleo ：有关物质的限度视具体药物而定，一般化学类药物限度多定为0.5%或1%，具体值根据生产工艺和实验研究结果，好像没有硬性规定，而像抗生素类生物合成或半合成的药物限度则较宽，甚至达到5~6%也可以。破坏性实验是为了考察方法的专属性，强碱、强酸、强氧化、强光、高温五个条件以使主药小部分降解为宜，降解产物与主药须达到完全分离。检测方式目前多用自身对照法。积分方式肯定不能用手动，定量不准确而且容易作假。应该根据具体图谱选择合适的积分方式，如果不是紫外低波长检测，估计不会有什么干扰，应把能目测出的杂质峰均积分在内。至于检测的可信性，也只能根据当前的技术条件选择较为合理的检测方法了。
