【求助】细胞复苏不成功

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标题:【求助】细胞复苏不成功

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发表于 2015-4-6 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠，请指点一下小妹！
我把细胞从-80度的冰箱拿出来复苏，期间没有污染，放二氧化碳孵箱后第一天在显微镜下看，发现很多漂浮的死细胞，贴壁的细胞很少，但培养液是清亮、桃红色的，液面上可见漂浮着很多死细胞（我用的是DMEM+10%胎牛血清的培养液）；我又把它放回孵箱；第二天看，和第一天一样，我就换液了；第三天看，镜下基本未见什么细胞了。之前师兄给我说这种细胞长得慢（甲状腺癌K1细胞），但是不至于不长，说明没有复苏成功。
请大家帮我看看，我是不是哪里出错了

mimili_901[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能的原因有：
-80度冻存细胞的时间太长，一般如果需要长期保存的话，超过一个月。最好转入液氮。
原有的冻存细胞状态就不好，表现为细胞活力不够，细胞密度不高。
换液太快，培养体系太大，如果细胞状态不好，最好保持较小的培养容积，以获得较高的细胞密度。如果培养基还是桃红色，说明细胞的代谢活动很弱，此时不宜换液。

xue258[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

10ml冻存的，现在复苏就用5ml，不知道你这个细胞是喜欢聚集生长还是离散生长。根据条件调节。比如，如果喜欢聚堆长，建议先倾斜培养瓶/皿，2h为一个时间间隔，观察细胞状态，以作调整。

101010[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

估计是细胞在冻存时消化过度，导致细胞状态不好。

veiwu[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果第一天能见到贴壁的话,说明还是可以的.有时候培养基颜色偏紫,细胞贴壁会有问题的.你核实一下你培养基颜色是否偏碱.如果偏碱,可以适当调高培养箱二氧化碳的浓度.或者换新的培养基.特别是开启过的培养基,适用时间长容易出现这个问题.

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也遇到以上情况，根据经验很多次像这样的情况都是细胞冻存过程出了问题，另外复苏细胞溶解要迅速，我们有时候水浴锅跳刀38度，甚至40度，目的是让其快速解冻，而且复苏第一次的培液血清浓度可以相对我高一点，等第二次换液时换回10%。个人见解，仅作参考。

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发表于 2015-4-6 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上各位的回答！
后来我又换了瓶细胞来复苏，这次这个细胞就是从液氮罐里取出来的，按照之前的操作，这次的细胞就活了，而且很快贴壁生长，说明之前的细胞当时冻存时状态不好，放-80度冰箱时间太长了。

feiya[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该是冻存的问题

vvmmoy[使用道具]
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发表于 2015-4-6 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

学习了，也可能是复苏时时间控制不好，冻存管中细胞转移到离心管时，要先打均，因为可能有些细胞会附在壁上；转移到离心管时，加10倍体积的含10%FBS的DMEM时，前几滴要加慢点，同时要稍微震荡。另外，接种在培养瓶中的细胞最好是5*10的五次方。

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发表于 2015-4-6 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果第一天能见到贴壁的话,说明还是可以的.有时候培养基颜色偏紫,细胞贴壁会有问题的.你核实一下你培养基颜 ...

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我昨天下午刚复苏了一个细胞，也有一大部分没贴壁的，培养基还很红，不知道今天早上该不该换液？

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