PCR一直没有扩增产物

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标题:[未解决]PCR一直没有扩增产物

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kflsjjfdl[使用道具]
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发表于 2008-11-24 22:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近设计了两条长引物，每条80bp，5‘端60bp用于之后的PCR片段转化进行同源重组，3’端20bp用于PCR扩增，模板是质粒，做了很多次，不断地改变退火温度，一直没有扩增产物，只有引物二聚体。请教各位，给点意见。谢谢!

实验技术[使用道具]
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发表于 2008-11-25 23:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的引物有点长。我做成功的最长的引物是57bp，主要由于超过60bp价格就要贵好多。

当时是“引物区”和“外挂区”的比例1:1，而你这个引物区只有20bp，外挂了60bp，比例是1:3，似乎太厉害了一点。一般不适宜挂这么大的片段，容易形成非特异扩增和二聚体。要加60bp的片段可以分两次来，一次30bp，会好做得多。而且价钱上来说一条80bp的引物的价格要比几条50bp的还贵吧。

如果一定要一次挂60bp的话，那就降退火温度吧，2度一下慢慢拉梯度试试看吧，运气好也许能出来。

chongwenmen[使用道具]
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发表于 2008-11-27 23:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么设计那么长的引物呀

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标题:[未解决] function setanswer(pid){ if(confirm("您确认要把该回复选为“最佳答案”吗？")){ document.delpost.action='misc.php?action=bestanswer&tid=4651&pid=' + pid + '&bestanswersubmit=yes'; document.delpost.submit(); } } PCR一直没有扩增产物

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