液质联用

我的样品在用LC-MS分析时，TIC图在30-50min有很严重的漂高，由于空白样品在相同条件下基本没有漂高，可以肯定是样品中的强保留杂质的干扰。大家能推荐一些好的样品纯化方法吗？

下面我具体介绍一下样品提取过程。
先用丙酮提取，N2吹干后，纯甲醇复溶，过滤后进样分析。

梯度如下：
time      A（水，0.1％甲酸）    B（乙腈 0.1％甲酸）
   0                    95                                   5
     10                   70                                   30
     30                   50                                   50
     50                   0                                     100
     55                   0                                     100

附件中Fig1 和 fig 2 分别是样品和空白的TIC图。

做生物催化代谢途径分析，确实会经常遇到类似楼主这样的问题，极性差别较大化合物的同时分离，多组分分析对样品前处理、色谱分离、质谱检测都提出了较高的要求！废话一句，呵呵。。。。
楼主的情况大概是这样滴：
试验目的：某些化合物生物催化代谢途径分析（或者是更深入的生源合成、生物转化、分子调控机制研究）
仪器设备：RRLC-ESI(/APCI)-MSD系统（Agilent 的液质，是复合源吗？）
主要通过检测前体化合物、代谢中间体、代谢终产物来追踪确认代谢通路
遇到的问题：复杂样品，结构类似物的色谱分离

这样考虑，个人认为：
1. 样品前处理——基于1楼的样品TIC图和8楼的化合物结构，可以查看一下“馒头峰”相应的分子量，能否跟目标化合物（前体、中间体、终产物）相关联，做代谢分析之前，诸如甲基化、乙酰化、脱羧、糖苷化等基本的代谢途径，心中大概有数滴，从分子量差异来初步判断是否跟自己关注的化合物相关。仔细分析，若不相关的话，就纯化样品，除去这部分吧（比如，把丙酮浸膏上大孔吸附树脂，采用不同体积的甲醇（比如30%MeOH）把目标化合物洗下来，杂质吸附在树脂上。我这里只是打个比方而已）。看你实验条件算不错滴了，也可以考虑不同吸附性能的固相萃取填料来纯化样品，SPE。
2. 色谱分离——既然知道目标化合物的大概结构，这样就比较好办了，楼主给出的化合物极性都算是偏小的了，建议提高乙腈的起始洗脱强度，比如从20%开始，60分钟内梯度变化到95%，看色谱分离情况如何？（说说我自己以前做天然产物色谱分离的情况吧：我通常是从5%-100%CH3CN，60分钟线性梯度，甲醇提取物，得到第一张图谱，根据主要色谱峰的保留时间及峰形，在这个条件的基础上进一步优化梯度洗脱条件，线性梯度或者是采取类似楼主的阶梯状梯度，这样一步一步下来，经过那么个3-5个实验就基本上可以确定色谱条件了。当然了，并没有所有的化合物都基线分离，自己关注的大部分化合物分离开就好。
“比如化合物1和2（结构式见附件）的Rt分别为18.78min和34.38min（从结构式判断，我认为化合物2的极性应该大一些，但是结果正好相反，难道化合物2属于脂溶性化合物？）。”
我猜楼主是因为看到化合物2多含个酚羟基，所以认为化合物2的极性应该大一些。其实，判定化合物的极性大小，首先是观察其结构母核基本骨架，然后再看官能团极性。芳环比内酯极性小，当然了，在这里说有马后炮的嫌疑。呵呵。。。。还有，这里，色谱分离过程中，化合物跟固定相作用的立体效应也不容忽视，自己之前做过相差一个双键的两个化合物分离，自己猜测是立体效应所导致的，虽没有去论证。

3. 质谱检测——既然楼主要做前体、代谢中间体、终产物的同时分析，那么质谱采集数据部分，楼主可以这么考虑：第一次实验，质谱部分：full scan 。然后呢，在第一次试验的基础上采用多离子反应监测模式multiple reaction monitoring mode (MRM) . 做代谢嘛，很多时候，做之前都有预测滴

总之，一句话：上面滴，其实楼主都明确的，这点偶肯定！自己很久没有这么系统地考虑问题了，自从工作后；

所以，说句废话，建议楼主从样品前处理、色谱分离、质谱检测3方面逐步开展自己的实验吧（个人觉得，楼主可以拿——菌体丙酮提取甲醇复溶溶液液，作为色谱条件优化分析样品，毕竟这个样品最脏最复杂，在楼主sample TIC 图的基础上，筛选色谱、质谱条件，色谱主要是考虑流动相体系及洗脱强度、质谱主要考虑正负离子全扫描、ESI or APCI 源、选择离子监测等，若能大致确定化合物的结构，甚至可以分时间段，采用正离子或者负离子扫描）
另外，做试验前，多查相关文献吧，尽量把相关文献找全。。。。

哎，什么时候，自己变得这么啰嗦了

[ 本帖最后由 aa_tang 于 2008-12-11 21:06 编辑 ]

什么样品啊？有没有查文献？

样品是液体培养的菌丝 查过的文献都是这样提取的 不过他们关注的重点和我的不同 我要看全谱 他们只是找一些自己感兴趣的目标化合物

全扫描，当然信息量比较多。样品中只要能离子化的东西，质谱都能检测到，所以样品TIC比较复杂；楼主如果只想对自己的东西感兴趣，您可以用选择离子扫描，图就会比较干净。

你的流动相是乙腈，为什么复溶时不用乙腈而用甲醇呢？

菌体代谢，楼主是利用LC/ESI-MS联用技术做菌体代谢谱分析还是筛选活性成分呀？只有明确了具体目的，才好设计实验方案。

菌丝体，经丙酮浸渍提取，氮吹至干，再甲醇复溶，滤过液进样分析。由于丙酮和甲醇的广泛溶解性，脂溶性和水溶性成分都可以提取出来，所以楼主采用5%-100%的乙腈梯度洗脱，样品复杂程度可想而知。。。。。。

即便是做菌体代谢全谱分析，楼主也可以调整一下自己的实验策略：

1. 样品前处理不变，优化自己的色谱分离条件，让流动相洗脱梯度时间更长，使小极性部分也都分离开，楼主为什么认定那是“强保留杂质”呢？呵呵，多问一句（我倒是认为你菌体代谢产物，很大部分是脂溶性化合物，因为你液相流动相的起始梯度5%乙腈洗脱强度比较小，而你大部分代谢产物都是在50%乙腈后才出来；明白楼主这么做是不想丢失大极性化合物）楼主的色谱条件是怎么确定的呢？我觉得，从给出的图谱来看，还不如用5%-100%乙腈，60 min 内，线性梯度洗脱。其实，从图谱表观上看，楼主的菌体代谢物主要集中在2段：RT:10-20min 和30min后的小极性部分，可以看出，楼主把10-20分钟保留时间内的化合物基本上分离开了，但30min后的都挤在一起，被一起洗下来了。若楼主，坚持前处理方法不变，可以优化30分钟后的化合物的色谱分离。当然了，如果“强保留部分”被认定是杂质，就没有必要做这个了，改变样品前处理方法，分析之前，想办法除掉脂溶性杂质即可。
2. 优化样品前处理：菌丝体和上清液，菌丝体经丙酮浸泡提取，过滤、减压浓缩至无丙酮，然后呢？采用不同极性的溶剂来分段提取。比如先后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇来提取不同极性的化合物，得到石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分，再分别吹干溶剂，再甲醇复溶，然后用GC-MS、LC-MS来做指纹分析。或者由于成分过于复杂，难于色谱分离，那么把不同部位的，再考虑过硅胶柱、大孔吸附树脂、凝胶柱等，初步纯化，再分析。依据自己的实验目的采取针对性的措施吧，罗马不是一天建成滴，O(∩_∩)O哈哈~

若真的系统地做下来，就不单单是一个分析前样品纯化的问题了，看楼主的实验目的和设备条件吧，若分析设备好的话，采用UPLC-ESI-MS，也有上百个峰容量滴，从水溶性到脂溶性成分都可以反映在一张图谱上，不过这样很耗时间和米米，呵呵。。。

甲醇和乙腈的溶解能力还是有一定差距的，根据文献报道，基本上都是用甲醇溶解样品。
至于流动相采用乙腈，是由于乙腈的末端吸收较低，而且柱压较低（我用的是1.8um的柱子）。

感谢aa_tang,分析得很全面，也很有道理。
我的目的其实是关注一个代谢途径的所有前体化合物和代谢终产物，它们的结构比较相似，都能溶解于丙酮，甲醇，应该属于中等极性化合物。虽然结构相似，但在上述条件下的保留时间相差比较大。比如化合物1和2（结构式见附件）的Rt分别为18.78min和34.38min（从结构式判断，我认为化合物2的极性应该大一些，但是结果正好相反，难道化合物2属于脂溶性化合物？）。所以其它化合物的极性相对大小也不能贸然判断。这就给样品提取和净化方法带来了难度。进行样品纯化又担心会损失目标化合物，不纯化又出现馒头峰。
关于您的建议，还有几个问题。
1. 我用的是aglient的RRLC系统，色谱柱也是配套的粒径1.8um的，相当于waters的UPLC了，但是结果你也看到了。
2. 您建议流动相用5-100％乙腈，60min内梯度洗脱，那么 在30min-60min内，乙腈的比例从50％-100％线性变化。
按照我采用的条件，在30-50min内也是乙腈含量50-100％。
这两个条件基本上变化不大吧。
感谢aa_tang能耐心看完，还能再给一些建议吗？谢谢！

非常感谢an_tang的分析和解答 非常系统 比我考虑的要周到
补充一点 我用的是AB的Q-tof elite
我会仔细考虑您的建议 多谢