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标题:【求助】PCR产物电泳没有条带

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发表于 2015-4-30 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】PCR产物电泳没有条带

有条带的是换了试剂盒后的β-actin，其余的都是目的基因的

我做了好多遍了，我用的是Fermentas的试剂盒，结果什么都没有！只有Marker有条带，我开始怀疑是cDNA不好，用核酸检测仪检测浓度19ng/ul，然后以为是加样问题，就重做，结果也没有，然后换了一个公司的试剂盒，β-actin跑出来了，但是目的基因还是没有，有一个基因条带很淡很淡，我以为是cDNA加得太少，就多加了一倍的的cDNA，结果还是什么也没有，郁闷中！下面是我的体系：
DreamTaqpcr Master Mix（含dNTP、缓冲液和Mg离子的）                   25ul
上游引物（10uM）                                                                                1.5ul
下游引物（10uM）                                                                                 1.5ul
cDNA（19ng/ul）                                                                                    1ul或者2ul
无酶水                                                                                                     补足50ul
另外一个试剂盒体系：
Taq酶buffer                                                                           12.5ul
上游引物（10uM）                                                                1.5ul
下游引物（10uM）                                                                1.5ul
cDNA（19ng/ul）                                                                   0.5ul
Taq酶                                                                                    0.5ul
无酶水                                                                                   补足25ul
PCR仪条件都一样
预变性                95℃                   3min
变性                    95℃                   30s
退火温度             50-65℃              30s
延伸                     72℃                   40s
循环40个
最终延伸               72℃                  8min


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 小中大
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发表于 2015-4-30 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近也在为这头痛...
下面个体系貌似没加dNTP
实在P不出，可以考虑下引物问题
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 小中大

唉，我这两天也P不出来，我怀疑是自己的引物不符合……
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 小中大
那个buffer里面有dNTP
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