液相色谱

请问C18柱如何保护，谢谢了，基本问题请给点建议。

色谱柱的保养：
1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；
2)当柱子和色谱仪联结时， 阀件或管路一定要清洗干净；
3)要注意流动相的脱气；
4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相；
5)进样样品要提纯；
6)严格控制进样量；
7)每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；
8)每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；
9)若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；

给你的建议

认真阅读色谱柱使用说明书;
使用填充良好的色谱柱;
尽量减少压力波动，避免机械及热冲击;
使用保护柱及在线过滤器;
经常以强溶剂冲洗色谱柱;
充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分;
用稳定的固定相(C18最稳定);
在中等pH值操作时(6～8), 用有机缓冲溶液;
色谱柱使用温度最好小于40℃;
硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的pH值范围在3.0～8.0;
在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠;
流动相中含有缓冲溶液，应注意用95：5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%。
过夜或贮存时, 冲洗掉盐和缓冲液, 用纯有机溶剂流动相保存(乙晴最好)。

怎样选择保护柱，但又不影响分离分析?这是色谱工作者经常提出的一个问题。通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁。对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱便能提供充分的保护作用。但是，如果样品非常不清洁，或工作中发现要经常更换1cm的保护柱，那么就应选择2cm或3cm长的保护柱。保护柱越长，自然所装填的色谱填料越多，则其越能避免污染物进入分析色谱柱的机会。当然，随着保护柱的长度加长，样品的保留时间会比使用短保护柱长。一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要。目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程很简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供很有限的保护作用;不过也因为所装填的色谱填料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。另一种保护柱结构其实质是缩短了的色谱分析柱，设计方式上有直连式、手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候由色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的保护柱长度。手紧式保护柱从结构上讲是与直连式保护柱一样，只是在连接时不需要借助扳手等工具，直接用手上紧即可。另外从保护柱结构的角度看，保护柱的结构又分为是否可以更换保护柱柱芯。现在大多数的保护柱均可以更换保护柱柱芯，可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全相匹配。

对于选择保护柱的原则是：在满足分析分离要求的前提条件下，尽可能地选择较短的保护柱结构，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。

可以加相似的预柱，防震，存放时以甲醇保护。

正相、反相和极性胶联柱使用手册

Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns

注意

此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂(pH>7.0)或酸性溶剂(pH<2.0)会导致柱子损坏。在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。未正确地使用不能享受保修待遇。

1. 简介

此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相(非水)条件。

反相(C8，C18，ODS，RP-8和RP-18)通常用于反相条件(水相)。

极性胶联型(APS，diol，CN和NH2)依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题(每一次注射之间和柱与柱之间的比较)。

2. 色谱柱老化

在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。

A.在反相条件下老化

要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。

在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗)。

如果流动相中使用了添加物(例如缓冲液或离子对试剂)，建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。

B.在正相条件下老化

柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥(激活)或润湿(失活)可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。

C.对于极性键合柱的特殊说明

由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。

3. 洗脱液

注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。

一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。

4. 流量和压力

注意：最高压力：不锈钢柱：4500psi;玻璃柱：3000psi

增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。

如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止(2分钟)。

拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。

高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。

使用保护柱(见第6节)会防止污染物沉积在分析柱上。

5. 样品准备

保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。特别地，要禁止导入颗粒杂质。这些最终都会造成操作压力的增高而且非常困难或者不可能去除。

6. 保护柱

一定要使用保护柱，因为样品和洗脱液污染可能会造成柱压力的增高而且影响选择性。对于ChromSep 柱我们建议使用正确型号的ChromSep 保护柱。这个柱子的填充材料与用于分析的色谱柱的材料相似。当柱压增高的或者观察到柱效降低的时候就需要更换保护柱了。对于常用不锈钢柱，我们建议使用相同型号的Chromguard High Efficiency(高效)柱(10X3.0mm) 或High Capacity(高容量)柱(50X3.0mm)。

7. 进样量和浓度

柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型。很难给出一个一般的指示。

注射了太大体积或太浓的样品会使峰展宽或者峰融合。

8. 温度

HPLC柱最好在柱温箱中使用。重复性取决于温度控制。最佳的温度与特定的应用有关。温度影响洗脱液流动的线速度。在使用ChromSep玻璃柱的时候，一定要调节流速使压力保持在3000psi以下。

9. 贮存

一定不要在柱子内充满缓冲液或者其他含盐类的洗脱液的情况下贮存色谱柱。 贮存溶剂应当含有至少20%的有机溶剂，以防止有细菌的生长。

10. 柱效损失的可能原因

1. 额外的峰展宽。当使用小直径或者长度较短的柱子时，峰展宽的情况可能比较明显。要保证管路的长度和内径都保持最小。检查进样体积和检测器检查池体积是否适用于柱体积。

2. 洗脱的平衡时间不够。

3. 不正确柱温。

4. 不正确的修正浓度。

5. 床压缩。使用了过大的洗脱流速。将柱子反向，使用低流速。

11.柱效丧失和/或高背压

1. 颗粒物积聚在烧结物或者树脂床上(它们都会使背压增高)。如果柱压增高了，将柱子与进样器断开，运行泵，以验证背压的来源确实是来自柱子的颗粒污染(样品、洗脱液和系统)。倒转柱子，以反向的流动来冲洗柱子。如果这样不能解决问题，更换进口过滤器或者筛板。

2. 微生物在洗脱液中生长。倒转柱子，尝试以反向的流动来将污染物冲洗出柱子。更换进口过滤器或者筛板。

3. 有蛋白质脂肪，油脂污染或者极性化合物等污染。再生柱子(见第12节)。

12.再生

1. 再生反相色谱柱

a. 首先倒转柱子。

b. 以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照水—甲醇—异丙醇—二氯甲烷—异丙醇—甲醇—水进行。

c. 柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。

注意：在使用另外的淋洗方法的时候，一定要先用水开始冲洗以去除缓冲液，保证其后的洗脱液可以混溶。

2. 再生硅胶柱

a. 首先倒转柱子。

b. 以大约最佳流速的40%的流速冲洗柱子大约45-60分钟，使用的溶剂的顺序要按照异辛烷(或己烷)—乙酸乙酯—干燥的异辛烷(或己烷)进行。

c. 柱子转回正常方向，使用分析所用洗脱液平衡。

3.再生极性键合柱

取决于使用的条件，可以使用反相的条件，也可以使用硅胶柱的条件。

注意：绝对不要使用酮类或醛类冲洗氨基柱，因为可能与固定相发生反应。四氢呋喃作为替代可以使用。