生物实验技术

我培养的是致密结缔组织中的细胞，反复经历挫折已经3个月了，精疲力尽，但是原代细胞还是没有培养出来，请各位高手指点一下小妹吧!谢谢啦!

具体细节：致密结缔组织为脊柱的黄韧带，外文文献上说的是组织块贴壁培养方法，具体细节为组织自手术室中取出后，我放入Dhanks液中，迅速转入无菌安全台操作，冲洗上面附着的骨、血和脂肪组织后，剪成很碎的小块，修剪的时候用的是低糖DMEM培养基浸泡，修剪完后用I型胶原酶加低糖DMEM消化，胶原酶的量为组织块量的20倍左右，消化时是在37度的co2孵箱内，消化完毕加入含有血清的培养基，1000转5min离心，去上清，剩余的组织块继续用 PBS冲洗，再次离心，最后剩余的组织块放入细胞培养瓶中，加入极少量的纯血清(PAA胎牛)粘附组织块，是为了让组织块贴壁稳定，5个小时后翻瓶，此时再加入含有20%血清的培养基少量浸泡组织块，这样做是为了避免组织块飘起，3天换一次液体...但是这样的方法做到现在，只发现有少量的细胞自组织块的周围爬出，而且不贴壁...怎么办呢?我的细胞培养瓶内页用多聚赖氨酸包被了...呜呜呜，郁闷啊;我也试过用消化发培养节省贴壁时间，但是不成功啊，有高手指点一下吧!1.看我的操作过程对不对;2.组织块贴壁法对于致密结缔组织何时能有细胞爬出，进而贴壁?3.如果采用消化法培养，具体怎么做，有何种特殊之处呢?谢谢指点!

贴壁法

我们一般这么做

用剪刀剪成小块后

离心后用少量完全培养基吹打混匀

把1ml枪头前端用剪刀剪掉

用此枪头吸取混匀的组织块如培养瓶(量大约为0.6ml)

在培养瓶底部摇匀，均匀覆盖底部后将培养瓶翻转

加入3毫升培养基

4小时后翻转

就不用另外换液了

有几个点我不太明白

1、你使用I型胶原酶是去除某些细胞还是让致密组织内的细胞脱离下来，看起来你好像是去除某种细胞。

2、5小时翻瓶是不是时间太长?

3、如果使用一次性塑料培养瓶，最好不用多聚赖氨酸包被。做原代尽量不使用玻璃培养瓶。

以上是我的理解，不一定准确，没做过致密结缔组内的细胞。

建议方法的改良

1、不用胶原酶消化，也许会出现杂细胞。且细胞原代培养周期长。

2、减少一次离心。第一次离心的时培养基多用一些。

3、消化后过滤网，然后加入培养基培养。剩余组织块贴壁。如果你使用胶原酶是为了取得某种细胞。

4、纯血清粘壁，翻瓶时间缩短，3小时?

5、不使用纯血清贴壁，改用完全培养基。

6、剩下的没什么建议了。看谁做过，帮你做一把。