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一)取材: 由于扫描电镜对样品表面的要求非常严格,清洗时要注意保护观察面不受任何损伤,且保持干净,否则,可导致观察困难或错误判断。做好观察面标记,以免样品制作过程中分不清观察面所在的位置。
取材时要做到“快、冷、准”三要点:
快,就是取材动作要快,一般要求在 2 、 3 分钟之内将组织浸入 2.5% 戊二醛内。
冷,就是取材的器械、固定液要事先放在冰箱内预冷。
准,就是取材部位必须准确,否则容易造成取材失败。
样品大小长宽一般不超过 5cm ,高度不超过 3cm 为宜。此外,实验动物取材部位不宜多,这样会延误取材时间,导致组织自溶等人为假象的发生。
(二)前固定:固定前清洗的组织离体后应在 1 ~ 2 分钟清洗完毕并投入固定液内;固定后清洗的组织离体后应在 1 分钟以内投入固定液。固定液要预冷。
(三)漂洗:用 0.1M 磷酸缓冲液漂洗 3 次,每次 15 分钟。
(四)后固定: 1% 锇酸固定液室温下固定 1 小时左右,夏天稍短,冬天稍长。
(五)脱水:利用不同浓度乙醇梯度脱水,由 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 各 15 分钟,换醋酸异戊酯 15 分钟或叔丁醇 15 分钟。
(六)干燥:可采用零界点干燥法和冷冻干燥法两种。
(七)镀膜:利用真空喷镀仪或离子溅射仪对样品观察表面进行镀膜,一般用金钯作为镀膜材料。
(八)电镜观察:观察者事先要熟悉所要观察样品的结构,做好观察记录,拍摄图象要及时存盘,并做好光盘刻录。