【求助】如何验证引物特异性？？

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标题:【求助】如何验证引物特异性？？

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发表于 2015-6-3 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的PCR结果除了目的条带还稳定地出现一条同样大小的非目的条带，我想应该是引物的问题，但是怎么验证引物扩增的就只有靶基因的目的条带还是有其他匹配的可扩增的非目的条带啊？
急切盼望各位高手指点！！

zhy平平[使用道具]
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发表于 2015-6-3 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

OLIGE。6软件就可以验证引物的特异性。。如果存在同源性你可以BLAST一下。我不知道你的非目的条带是指什么？如果在100BP一下的应该是引物二聚体。。做普通PCR影响不大。。荧光定量的就不能有任何非目的条带。。我建议你提高一下退火温度。。每次提高3-4度随着温度的升高目的基因的特异性就越高杂带就越少。。但是目的基因扩增出来的量就会变少。。如果提高温度不行那就要换换引物。。不要轻易更换引物。要反复的做预试验。。

memory[使用道具]
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发表于 2015-6-3 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢啊！
我说的非特异条带不是引物二聚体，退火温度也提高试过了，还是有。
但是olige.6和blast我还不怎么会用啊，能否有具体的操作方法啊？
谢谢了啊！

zzzz[使用道具]
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发表于 2015-6-3 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下

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2015-6-3 09:36

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发表于 2015-6-3 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口

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发表于 2015-6-3 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开

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2015-6-3 09:37

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发表于 2015-6-3 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
先天性卵巢发育不全综合征
选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”

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2015-6-3 09:37

95453032.gif (13.93 KB)

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发表于 2015-6-3 09:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
电击伤
出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”

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2015-6-3 09:38

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发表于 2015-6-3 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。

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2015-6-3 09:40

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发表于 2015-6-3 09:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3

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2015-6-3 09:40

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