PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】引物间形成二聚体怎么办？

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标题:【求助】引物间形成二聚体怎么办？

jude[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】引物间形成二聚体怎么办？

因为基因片段是固定的，两侧的酶切位点也是固定的，所以别无选择。但引物间形成了比较多的二聚体，使产物很少。
这种情况该怎么处理啊
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为应该在PCR程序中，把循环中的退火温度提高才对，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。
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dog002[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有一种特殊的引物方案可以最大限度地减少引物二聚体。
此方法是在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个循环时引物二聚体产物会自身退火形成发卡结构而阻碍继续扩增。具体的文献不在手边，有空再替您找找^_^
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
多谢各位，可惜我这段序列是插在GST载体上，不能随便改酶切位点的。所以只能用目前的引物。
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kulee[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兄弟，酶切位点不会改变的，只不过是在原有引物序列的5‘端加上一段额外序列，P完后用酶切一下不就ok了么？
文献为:
Jannine Brownie, The elimination of primer-dimer accumulation in PCR, Nucleic Acids Research, 1997,25:3235-3241
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bring[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考虑一下用热启动Taq酶吧，我记得好像QIAGEN 和Invitrogen都有一种HotStarTaq DNA polymerase, 该酶在室温时是没有活性的，必须95度15 min进行热激活，这样在热激活的时候使室温配PCR反应体系时引物形成的二聚体解链，接下来直接进入PCR，形成引物二聚体的机会就少多了。值得一试，只是该酶比较贵。
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969[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

QIAGEN的hotstar比较好使,的确挺贵，但是有时候也不是适合所有的反应。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的经验是：使用booster PCR.尽量降低引物浓度，使引物和模版的浓度比降下来，提高模版对引物的竞争力。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2015-6-3 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一直在用hotstar，感觉不错。
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