【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题

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标题:【求助】一个做qPCR时RNA和cDNA浓度的问题

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发表于 2015-6-3 17:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做realtime有段时间了，现在有几个疑问请教大家，
一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致，最后得到的cDNA就不再测浓度，直接加1ul进入25ul的Sybrgreen反应体系。
但是即使加入的RNA量一致，但是转录后得到的cDNA量都是有差别的，我最近测了一批cDNA浓度，样本间的差异比较多，现在的问题是：我是否需要根据cDNA的实际浓度调整加进去的cDNA溶液体积，使得实际每管cDNA的量相同？
还有个问题就是：因为只要相对表达量，每个基因都有要和管家基因相比较，这样一来是不是其实真正加多少cDNA进去并不重要了，因为最后都会normalized by housekeeping gene?
这两个问题想了很久，想听听大家的意见

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发表于 2015-6-3 17:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人不是特别赞同你的“一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致”这一做法。如果做很多，那岂不是很麻烦。而且似乎根本无法保证RNA浓度都在同一起跑线上。
我的解决办法就是同时作内参的表达量然后计算相对表达量

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发表于 2015-6-3 17:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是这样。一般提取组织后测RNA的浓度，然后反转录的时候保证reaction mixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录体系都是一样的，理论上讲（建议用multipipetide）你生成的cDNA也是一样的。
我最近也在想为什么cDNA的浓度不一样。楼主我们再讨论。我觉得用OD值测cDNA。其实测到的什么都有。有cDNA，有dNTP,有残余的oligoDT，还有未完全转录的RNA。很难说清楚到底那里面有多少是cDNA。所以不建议测cDNA的浓度。其实我做实验还发现了一个问题。这个cDNA的浓度是否一致和RNA的质量有关。OD260/OD280越高，有机物污染越少，cDNA就越一致。反之，他们相差很大。
第二个问题，我同意你的观点。每组样品中，只要和house keeping gene比较，那么加入的cDNA的量是不重要的。但是要保证每次一致。

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发表于 2015-6-3 17:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上两位朋友的意见！
谢谢楼上朋友关于“用OD值测cDNA。其实测到的什么都有。有cDNA，有dNTP,有残余的oligoDT，还有未完全转录的RNA。”的解释，
对于“cDNA的浓度是否一致和RNA的质量有关。OD260/OD280越高，有机物污染越少，cDNA就越一致。反之，他们相差很大”我想有这个可能性。
今天特地做了一次对照试验（我是用Qiagen的kit提取RNA，RNA的260/280接近2.1）：
同一个样本的RNA做两次cDNA合成，横向比较，同时不同样本RNA也做cDNA合成，结果很有意思，同一个样本的cDNA终浓度非常接近，不管cDNA的260/280是1.8或2.1；而不同样本的cDNA浓度间的差异似乎和260/280的值相关性不好分析，即使在RNA的260/280接近2.1时cDNA浓度也有相差明显的。
现在的问题是如果260/280的值都很相近，还有什么其他可能因素是引起cDNA浓度不等的原因么？
不知道说清楚问题没有，谢谢大家！

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发表于 2015-6-3 17:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有反转录效率问题。

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发表于 2015-6-3 17:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

既然做了内参的表达分析，为什么还要控制起始RNA的量呢？

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发表于 2015-6-3 17:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 am10 于 2015-6-3 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人不是特别赞同你的“一般提取组织RNA后都会测量浓度，然后根据RNA浓度调整体积，使得进行转录的RNA总量一致”这一做法。如果做很多，那岂不是很麻烦。而且似乎根本无法保证RNA浓度都在同一起跑线上。
我的解决办法就是 ...

首先，cDNA不能用测OD值的方法来确定浓度。OD值能直接测的是单链和双链核酸，所以你不能直接将蛋白稀释了测OD值来确定浓度，而要加上考马。RNA（单链）和质粒（双链）就可以直接稀释来测。逆转录后样品里成分复杂，虽然CDNA含量最多，但具体结构不能确定，不能测OD值。

请问，假如你要检测某细胞系加药后某基因的表达情况，你怎么比较？如果以不加药作为对照，检测不通时间点的表达情况，你的RNA起始量就不一样，你怎么比较之间的差别？
是，我们要比较的是相对变化，但那也是有条件的。起始RNA量不一致，你的样品之间差别能保证不是因为RNA量的不同引起的？就像WB，为什么每次都要看actin或者GAPDH等蛋白表达是不是很齐？照你这样说，我只要用软件计算各自泳道里目的蛋白与内参蛋白的差值再比较久行了，现在这样的软件多的是还免费的呢。
如果你真是那样做的，试验数据和结果是不可信的。有意见我们可以再讨论！

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发表于 2015-6-3 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于realtime，模版没必要定量，因为实验过程中，每个模版都会加一个内参的检测。
对于相对定量而言，我们假设模版的内参的表达是固定的。样本之间的比较是以这个为基础的。尽管具体反应的时候每个模版的用量可能不同，但是后期我们通过依据内参对数据进行处理，得出两个样本某个基因表达的差异。
对于绝地定量，是需要做标准曲线的，对于每个模版也没必要事先定量，而且通过实验后的到的ct值，在标准曲线上可以得出该样本的用量的。

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发表于 2015-6-3 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，cDNA不能用测OD值的方法来确定浓度。OD值能直接测的是单链和双链核酸，所以你不能直接将蛋白稀释了测OD值来确定浓度，而要加上考马。RNA（单链）和质粒（双链）就可以直接稀释来测。逆转录后样品里成分复杂，虽然CDNA含量最多，但具体结构不能确定，不能测OD值。
请问，假如你要检测某细胞系加药后某基因的表达情况，你怎么比较？如果以不加药作为对照，检测不通时间点的表达情况，你的RNA起始量就不一样，你怎么比较之间的差别？
是，我们要比较的是相对变化，但那也是有条件的。起始RNA量不一致，你的样品之间差别能保证不是因为RNA量的不同引起的？就像WB，为什么每次都要看actin或者GAPDH等蛋白表达是不是很齐？照你这样说，我只要用软件计算各自泳道里目的蛋白与内参蛋白的差值再比较久行了，现在这样的软件多的是还免费的呢。
如果你真是那样做的，试验数据和结果是不可信的。有意见我们可以再讨论！
......

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用药前后比较目的基因与内参基因的比值不就可以了么？为什么非要起始RNA量一样呢？我就不相信你能调到某几个RNA的量一样。个人觉得作内参，其实就是克服无法统一起始RNA量的难题，如果起始RNA量一样，还作内参干吗？
再讨论。。

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发表于 2015-6-3 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

内参就是用来衡量起始RNA量是否一致。

附件

2015-6-3 17:22

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