小中大上述sdsd 打的看病的比方与insulin战友的[教训]在逻辑上没有任何相关性,这是典型的偷换概念.insulin 战友想要获得正确的PCR产物,其中要用到一个自称是非常好用的工具,但这个工具所带来的结果不但事与愿违,而且令人瞠目结舌! 这就是故事的核心内容.按sdsd 的逻辑,那就是本来没有什么病,被庸医折腾成了大病.
事实上,普通Taq酶扩增1.5kb也不大可能产生5个左右的突变.另外还有人用TAKALA的LA Taq扩增GFP竟然也发生了四五个突变(坛上可以搜索到),GFP才有多长啊?不过800bp!有些科研人员选用高保真酶就是想尽量减少突变,以利于做克隆表达或功能研究,何曾料到,声称既有长效扩增机制且又具校正功能的LA Taq
却是如此这般?!
撇开逻辑,下面我们来谈专业知识:
突变率的多少，与PCR所用引物的特异性有关吗?
如果引物特异性差,其结果就是:要么产生非特异性扩增,要么没有产物.如果是非特异性扩增的话,还谈什么突变率呢?!垃圾产物,Discard!如果没有PCR产物,拿什么去测序,还怎么计算突变率?
模板序列有问题吗?
这是有可能的,但Clontech的质粒中的GFP序列有问题吗?购买时它可是随载体序列一到送到客户手中的呀!质粒是一个样子,序列又是另一个样子?
本人作为技术顾问,曾受聘于多家生物技术公司(包括美国),有时也帮助宣传,但从来都是本着科学的态度去帮助回答问题和解决问题,在事实面前不说假话,这是一个科研工作者应具备的最基本的素质.下面是关于耐高温DNA聚合酶的一些知识,希望能对大家有所助益.
<高温DNA聚合酶的选择>
耐高温DNA聚合酶的选择对于实验目的、实验的准确性、稳定性等均是成败攸关。从扩增的速率和忠实性来考虑, 耐高温DNA聚合酶可分为三类：
第一类：扩增效率高,但没有校正功能。该类聚合酶具有很强的从5’→3’方向合成DNA功能，但没有从3’→5’方向外切酶的活性。该类酶的合成效率高，但合成过程中出现的错误不能被有效纠正，我们的实验数据表明，在80%的克隆中，每一个kb可能会产生1～2突变。该类酶的代表就是普通Taq 酶（Taq DNA Polymerase），它扩增效率高，广泛应用于DNA片段大小的鉴定和菌落克隆鉴定，由于该酶尚能在合成的DNA的3’端羟基上加A，故而还用于PCR产物的T载体克隆。因该类酶不具有纠错功能，因而其扩增产物不宜用于基因突变检测和以基因表达及功能研究为目的之基因克隆。市售的所谓Platinum Taq 据称有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但笔者在美国做博士后研究期间用它来做批量克隆，测序结果发现其突变频率与普通Taq酶没有多少差别，对其印象深刻，因而它应被归类为普通Taq酶类。
第二类：既具有5’→3’方向合成DNA的功能，又具有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但DNA合成效率与普通Taq 酶相比大大降低。Pfu DNA 聚合酶便是这一类酶的代表，据称，Pfu的保真度在所有耐热DNA聚合酶中是最高的。我们以Pfu作为批量克隆中的工具酶，测序结果表明，0.8～1.5kb 的扩增片段，50%的克隆发现有突变；而1.8kb以上的扩增片段克隆中，突变的发生几乎无一幸免。
第三类：兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq 酶与Pfu DNA 聚合酶按一定比例混合即可（如Taq Plus, LA Taq, Ex Taq），并为很多公司和研究者所采用，但混合后由于二者对底物模板存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果，于是，用基因工程的方法获得理想的第三类酶便成为PCR领域的一块研发高地。XXX公司科研人员，利用丙氨酸扫描技术鉴定出聚合酶和外切酶活性的最小结构域和相关的活性位点，进而用遗传学和基因工程方法获得既能高效扩增又具有很强的校正功能的金牌Taq （FG Golden Taq DNA Polymerase），稳定性高于普通Taq酶，纠错功能强于Pfu (见下表)
PCR产物克隆的基因
p53 NF-kB hRAD17 SP1 Apo-AV PPARγ SRC1
片段大小
1.2 kb 1.7 kb 2.0 kb 2.4 kb 1.3 kb 1.43 kb 4.2 kb
获得无突变序列所筛选的克隆数
FG Golden Taq
1, 1, 1, 2, 1, 1, 2,
Pfu
2, 3, 3, 4, 2, 3, NA＃
＃备注： NA 代表Not Available
