液相色谱

高效液相色谱法同时检测水产品中磺胺类、硝基呋喃类、 喹诺酮类等抗生素残留量



　　李佐卿 倪梅林 章再婷 谢东华 俞雪钧 殷居易 湛嘉

　　宁波出入境检验检疫局 宁波　315012

　　摘要：本文论述了高效液相色谱法检测水产品中磺胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类等合成抗生素残留量的方法。样品以乙腈为提取剂，经脱脂、浓缩、净化，用流动相溶解。用高效液相色谱法测定。本方法通过梯度洗脱将15种抗生素进行良好分离，应用紫外检测器测定磺胺类、硝基呋喃类、乙胺嘧啶等抗生素，将荧光检测器串联来同时检测氟喹诺酮类，利用荧光检测器的波长可变程序，又能检测恶喹酸。检测到的阳性样品又建立了HPLC/MS-MS方法进行确证。喹诺酮类标准曲线线性范围0.005-0.2 µg/mL，磺胺类、硝基呋喃类标准曲线线性范围0.05-0.8 µg/mL，线性相关系数 r=0.9837—0.9975。实验回收率分别为62.2%—88.6%,检测低限在1-50μg/kg不等。

　　关键词：水产品，磺胺类，硝基呋喃类，喹诺酮类，残留，液相色谱，测定

　　磺胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类等合成抗生素均为常见的合成抗菌剂，在畜禽和水产养殖中使用十分普遍，但通过任何途径摄入的抗菌素会在人体中蓄积，导致许多细菌产生抗药性，磺胺类残留能破环人的造血系统，造成溶血性贫血症，磺胺二甲嘧啶等甚至有引起潜在致癌性的可能[1]。硝基呋喃类连续长期应用，能引起出血综合征。如不执行停药期的规定，在鸡肝、猪肝、鸡肉中有残留，其潜在危害是诱发基因变异和致癌性。喹诺酮类是具有广谱抗菌作用的药物，毒性较低[2]，与茶碱类合用时可能出现茶碱中毒症状，如恶心、呕吐、震颤、不安、激动、抽搐、心悸等，应用氟喹诺酮类药物可发生中、重度光敏反应和光毒性反应。喹诺酮类可致重症肌无力症状加重，呼吸肌无力而危及生命。喹诺酮类药物有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性。这些抗生素检测方法上有酶联免疫法 [3，4]、放射免疫法[5]、液相色谱法[6-8]、荧光光度法[9]等，测定对象不同前处理和色谱条件也不相同。本实验的目的是建立一套比较科学可靠的高效液相色谱法检测水产品中磺胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类等合成抗生素残留量的方法。以便适应国内外的市场要求。

　　1 试验部分

　　1.1 仪器和设备

　　高效液相色谱仪配置紫外检测器、荧光检测器;色谱柱Clovsil-C18;超声波细胞破碎仪;旋转蒸发仪;高速离心机;固相萃取装置 SUPELCO。

　　1.2试剂和溶液

　　恩诺沙星(100%)、盐酸环丙沙星(99.7%)、诺氟沙星(99.6%)均由中国兽医药品监察所提供;磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、乙胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、恶喹酸、呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因均由sigma公司提供;乙腈、甲醇、正己烷为色谱纯，其余试剂均为分析纯;二次重蒸水自制;提取液均采用乙腈;用流动相最终定容。

　　1.3 样品处理

　　将样品解冻，剪成小块打浆，于50mL离心管中称取5.00g样品，加入10.0g无水硫酸钠用玻璃棒充分搅匀，加入20mL乙腈涡流混合2 min，再超声波细胞破碎20s，然后5000r∕min离心分离5min，上清液倒入预先加有30mL用乙腈饱和的正己烷的分液漏斗充分振荡静止分层，下层乙腈层放入旋转蒸发瓶中;离 心管中的残渣再用10mL乙腈提取二次，上清液倒入原分液漏斗充分振荡静止分层，下层乙腈层并入原旋转蒸发瓶，加入10 mL异丙醇，40℃旋转蒸发近干，(若样品杂质过多影响测定则进行净化步骤)，准确加入1 mL流动相经涡流混合、超声波清洗将附着在瓶壁上的物质充分混匀，再将溶液倒入高速离心管离心2 min(12000r∕min),上清液作HPLC分析。

　　1.4 样品净化

　　在蒸发近干的旋转瓶中加入5mL0.05 mol/L磷酸二氢钠经涡流混合、超声波清洗将附着在瓶壁上的物质充分混匀，溶液上预先处理的固相萃取装置，重复加入5mL0.05mol/L磷酸二氢钠经涡流混合、超声波清洗再上柱，5mL甲纯洗脱，氮吹至干准确加入1 mL流动相经涡流混合，取样进行HPLC分析。

　　1.5 色谱分析条件

　　高效液相色谱系统,带二极管阵列检测器和荧光检测器，色谱柱：Clovsil-C18 4.6mm×250mm,5μm，柱温：40℃。流动相为乙腈、乙酸2%、水，梯度洗脱，流速为1.0mL∕min。荧光检测器激发波长280nm发射波长450nm，在13min以后改为激发波长260nm发射波长380nm。

　　1.6 标准曲线的绘制

　　称取磺胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类等合成抗生素标准品各0.0100g，用乙腈/水(4+6)溶解，配成浓度为200mg/L储备液，置于4℃冰箱中存放。

　　用移液器吸取储备液各20μL，用移液器加入乙腈/水(4+6)若干，配成4μg/mL标准中间液，每周现配。

　　用标准中间液加适量流动相稀释成适当浓度的系列标准工作液，每次进样20μL测定。

　　2.结果和讨论

　　2.1 样品前处理

　　样品前处理过程中提取剂的提取能力是有很大差异的，而15种磺胺类、硝基呋喃类、氟喹诺酮类药物的极性差异很大，一般采用乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯以及盐的缓冲溶液等混合溶剂进行提取。我们曾采用乙腈/二氯甲烷/乙酸乙酯(3/4/8)、(4/5/6)、(4/2/3)、(2/1/1)及乙腈/二氯甲烷(1/1)、二氯甲烷/乙酸乙酯(3/8)、二氯甲烷/丙酮/乙酸乙酯(1/1/2)、和纯乙腈等作提取剂。但回收率各有优劣，但对氟喹诺酮类以乙腈回收率较高，实验采用乙腈为提取剂。

　　样品预先加入10%硫酸钠溶液和无水硫酸钠进行彻底混合两种方法进行盐析作用，促进提取剂对药物的提取。但试验结果以无水硫酸钠效果为佳，特别对于氟喹诺酮类药物中的诺氟沙星、环丙沙星更以无水硫酸钠为佳。

　　超声波细胞破碎仪的应用可有效促进细胞破壁,加大样品分散程度，加剧细胞内容物的溶出，从而提高实验提取效率。提取溶液中的杂质采用正己烷液液萃取除去弱极性脂质、采用固相萃取装置去除强水溶性杂质，避免提取反提取的复杂模式，以缩短实验步骤，在杂质干扰不是很明显的情况下可以考虑省略固相萃取以减少实验费用，而且有利于提高实验重现性。在二极管阵列检测器和荧光检测器双检测器同时检测的情况下，基本上可以省略该步骤。

　　2.2色谱柱的选择

　　对于磺胺类、硝基呋喃类、氟喹诺酮类药物的HPLC分析近年来多采用C18等反相柱[4，5]。实验分别对ZORBAX SB- C18,XDB- C8,Hypersil ODS- C18,BDS- C18，YMC- C18，Clovsil-C18柱进行了比较,结果在SB- C18、XDB- C8上对氟喹诺酮类药物获得了良好的分离效果，YMC- C18对磺胺类药物获得了良好的分离效果，但Clovsil-C18柱对以上几类药物均有良好的分离效果。故选择了Clovsil-C18柱。

　　2.3流动相的选择

　　氟喹诺酮类药物具有可质子化的氮原子和可离解的羟基，它们在水溶液中通常以离子形式存在[1]。选用适当的离子对试剂有利于分离。在不采用任何离子对试剂只用乙酸调节PH的情况下，ZORBAX SB-C18,XDB-C8,HERPSIL ODS-C18,BDS-C18上都不能得到良好分离，普遍存在出峰过早、标准品之间分离不完全、峰拖尾等情况，尤其是在ODS-C18(未封端)上根本不出峰，高浓度时验证，该条件下峰宽展很厉害，以至于低浓度时不能看到正常的峰，由此也可以看出残留硅羟基的负面效应。但Clovsil-C18柱用乙酸调节pH的情况下，对以上几类药物均有良好的分离效果。本文采用了乙腈、2%乙酸为流动相，该流动相柱后测定pH为3，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱。

　　2.4色谱行为

　　在本实验中磺胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类标准品的保留时间见图1，保留时间偏差小于3%。大的杂质峰大多在5分钟前流出，所以基本不会造成干扰。磺胺类和乙胺嘧啶用紫外检测器检测，紫外吸收波长275nm或254nm，用荧光检测器与紫外检测器串联来检测氟喹诺酮类和恶喹酸，荧光检测器激发波长 280nm发射波长450nm，在13min以后改为激发波长260nm发射波长380nm来检测恶喹酸。液相色谱-紫外光谱-荧光光谱图见图1。

　　2.5 HPLC/MS-MS的确证

　　我们对除了硝基呋喃类以外的12种抗生素建立了HPLC/MS-MS的以氘代试剂为内标的确证方法，对检测中的可疑样品进行确证(见图2)，由于 HPLC/MS-MS采用1个母离子，两个子离子进行确证，色谱分离不必很好，故分离更快。而且用于HPLC的样品如有可疑，可直接用于确证，不必重新进行前处理，该方法可直接用于测定。对于硝基呋喃类我们另外建立了一套代谢物的HPLC/MS-MS的测定、确证方法。

　　2.6 标准曲线

　　喹诺酮类药物的混标浓度分别为0.005、0.01、0.05、0.1、0.2 µg/mL，磺胺类的混标浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 µg/mL，仪器对各点分别重复测定三次，结果取平均值，然后建立标准曲线，线性相关系数 r=0.9837—0.9975。

　　2.7精密度、回收率和检出限

　　重复进行同一样品的5份测定，统计数据的重现性，RSD在5.85%—9.12%，以添加喹诺酮类各100ng标准品(相当于0.02 mg/Kg)、磺胺类各500ng标准品(相当于0.1 mg/Kg)进行回收率试验，得到理论测定浓度为0.1μg/mL和0.5μg/mL,其平均回收率为62.2%—88.6%。在以上精密度、回收率试验建立完善后，在样品添加各个标准品至最小量进行测定确定本实验的检出限。采用荧光检测器检测灵敏度很高，实验又对喹诺酮类添加2.5ng标准品进行了测定，理论测定值应为0.5μg/Kg,实际测定值扣除背景为0.3μg/Kg左右，回收率不高而且变异系数较大，但尚可检。由此可见仪器的检出限小于 0.5μg/Kg，考虑到样品基体干扰，本实验能达到检出限为恶喹酸、诺氟沙星、环丙沙星2μg/Kg，恩诺沙星1μg/Kg，仪器对恩诺沙星的灵敏度比恶喹酸、诺氟沙星、环丙沙星都要高;实验又对磺胺类添加250ng标准品进行了测定，理论测定值应为50μg/Kg,实际测定值扣除背景为25μg/Kg 左右，回收率不高而且变异系数较大，但尚可检。由此可见仪器的检出限小于50μg/Kg。但磺胺二甲嘧啶的灵敏度和回收率比其它的磺胺要高，以上说明恩诺沙星和磺胺二甲嘧啶相对于其它同类检测要容易些，这与有些文献中的论述相一致。

　　参考文献

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　　[2] Somasundaram,C.,Matzku,S.,& Nicklas,W. In Vitro 28A,19921,708-710.

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　　[6] Balizs,G.,Benesch-Girke,L,& Borner,S.et al,J.Chromatogr.B 661, 1994,75-84.

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　　[9] Waggoner t.b.,& Bowman,M.C.,J.AOAC Int.70,1987,813-818.

　　Determination of sulfanilamides, nitrofrans and fluoroquinolones Residues in aquatic products by HPLC

　　Li zuoqing Ni meilin Zhang zaiting Xie donghua Yu xuejun Yin juyi Zhan jia

　　(Ningbo Administration for Entry-Exit Inspection and Quarantine Ningbo ,315012)

　　Abstract: This paper is about the HPLC method for dectecting the residue medicines such as sulfanilamides, nitrofrans, and fluoroquinolones in aquatic products. The samples are extracted by acetonitrile and the extract is then defatted , concentrated, purified and dissolved by the mobile phase. The prepared samples are determined by HPLC. 15 kinds of antibiotics can be well separated by this method using gradient elution. The antibiotics such as sulfanilamides,nitrofrans and Pyrimethamine are detected by VWD, while fluoroquinolones by FLD. Oxolinic acid can be determined using the transformable wave procedure of FLD. The positive samples will be corroborated by HPLC/MS/MS. The linearity of fluoroquinolones standard curves are kept in range of 0.005-0.2 µg/mL, The linearity of sulfanilamides, nitrofrans standard curves are kept in range of 0.05-0.8 µg/mL with average recoveries 62.2%—88.6% respectively. the correlative coefficient r is 0.9837—0.9975. The detection limits are 1μg/Kg-50μg/Kg .

　　key words: aquatic products, sulfanilamides, nitrofrans, fluoroquinolones, residue, HPLC, detection