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标题:【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果

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发表于 2015-6-5 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果

在此讨论我们实验室沉痛教训，以使大家借鉴。
在2006年7月至9月22期间，本实验室委托上海生工通过济南代理合成了十几对引物，期间，我们启用了10对引物。实验室伙伴们将目的基因扩增并链接T载体后，委托合成引物同一公司测序，结果发现，10对引物中有5对引物错误:
1:少了一个碱基
2：多了两个碱基
3：错了一个碱基
4：上游引物与下游引物合成的序列完全一致（给我们丢了下游引物）。
5：出现终止密码子一对
上述错误在10对中占有50%的比例，此错误比例惊人，给我们实验室造成严重损失，不仅仅剩余的几十对引物不再敢启用，更重要的是，这半年的工作白费，浪费了人力物力，更延误了我们与某公司签订的合同期。
我们已经与上海生工进行了联系，公司副总李瑞峰经理进行了查证，生工总经理王珞珈表示了道歉。
本科室发布通牒，以后不许在上海生工合成引物，不可靠的引物会对工作造成严重损失，时间是不可挽回的！！！
谨以上述实例提醒大家：当你的PCR做的结果不可思议时，请考虑引物问题。
cuturl('http://www.microbiology-sd.cn/')
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qhyu[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

恐怖啊，不像是聚合酶错配啊。
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发表于 2015-6-5 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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可不是一般的恐怖啊，终于有人同情我了，呜呼，我们被上海生工合成的错误引物炸的休克了啊！连续5个啊～想：PCR扩增获得目的带、连接到T载体、再转化大肠、重复PCR鉴定、测序...多少工艺啊，多少劳动和汗水，全部损失掉～不休克才怪！
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woshi[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我就用过生工的引物一次．谢谢提醒了
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caihong[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像是生工的很多产品都不成熟！
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发表于 2015-6-5 09:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有同感, 我合成的一对引物P不出条带,连非特异性都没有, 多谢提醒
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发表于 2015-6-5 09:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

真是无语,对楼主得遭遇真是绝对得同情,哎,现在得合成市场就是这样,大家一直都在搞价格战,结果受害得最终是我们做试验得学生!
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KGZ564[使用道具]
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发表于 2015-6-5 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是搂主的运气差些吧。
我主要在上海生工合成引物，这三年总共有差不多1万个碱基吧，其中大部分是用来做全基因合成的，觉得错的不多。一般合成500bp的基因（共需要合成1000bp的引物）挑4个测序，有2个是完全正确的。
相反，我觉得上海生工的测序要差些。10个样品通常会有3个左右测不出来（之后同样的样品，同样的引物让广州英骏就测出来了）
总体来看，我还是比较信任生工的引物合成的，测序则首选英骏。
忘了说一下，生工引物合成有的在上海，有的在北京。应该是前者好些。
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发表于 2015-6-5 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
呵呵终于找到“真凶”了，原来是楼上的Pathway害的我啊，苦啊，连续5对引物啊，你想，从设计引物，等待你合成，然后PCR扩增、连接T载体、转化大肠、提取质粒、酶切鉴定、PCR...等，最后又测序，惨重啊！！！
根据KGZ所说，可能是测序出了问题，我非常希望是测序问题！但是，无论是那个问题，都不应该啊，造成的损失太惨重了，哭～～～～啊
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发表于 2015-6-5 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不争吵，在我发这个帖子之前，我已经跟你们生工副总李瑞峰交涉了，他对生工的错误进行了查证，总经理王珞珈进行了口头的道歉，并已通知财务取消所有您的余款挂账。
我们在生工的帐务很少，只是对损失的半年时间感到不平！我们有来往书信，你想读吗？kgz？
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