手性分析

想咨询一下大家，如果手性化合物盐的形式（盐酸盐或三氟乙酸盐等），大家一般用什么手性色谱柱分离？都是用*-RH的柱子吗？我们的解决办法是将盐游离成有机碱或有机酸后在正相手性柱上进行拆分，一般都能成功。
我们*-RH的柱子只有AD-RH的，一般成盐形式的化合物都分不开。

另外，还有个疑问，*-RH和相应的*-H的色谱柱在分离化合物上除了使用流动相的差别外，还有什么差别？同样一个化合物如果能在AD-H上拆分开的话，如果溶解度准许，是否一定也可以在AD-RH上拆分开呢？或者他的盐是不是也能够在AD-RH上拆开呢？还请高人指点一下，谢谢！！

我们的盐做手性都是直接稀释进样，正相反相都可以，前后有大概二三十种盐，包括盐酸盐、三氟乙酸盐、甲基磺酸盐、酒石酸盐以及其它更复杂的盐。
以AD填料为例，最开始的色谱柱是AD，后来开发了高效的，叫做AD-H，主要是填料颗粒从10um变为5um，这两个都是正相柱现在已经有了3um填料，再后来开发了反相使用的，就是AD-RH，。但是这些色谱柱都是涂覆型填料，不耐溶剂，现在开发了键合型的，叫做IA，既可以正相也可以反相，可以用二氯甲烷、THF和DMF等做流动相。
一般来说正相可以选择的溶剂种类和范围比反相要大，分离效果也是正相比反相好。用大赛璐的手性柱，我90％以上的手性化合物都是用正相分，到现在为止至少分开了几千种，只用AD-H和IC两只色谱柱就行。

谢谢！您的经验一定很多。我做的成盐的化合物，尤其是盐酸盐，很少能够用正相色谱柱分开的，不知您是一般用的什么条件拆分开的。请举个例子好吗？谢谢！

不客气。
这个问题有点复杂，如果不涉及商业机密的话，建议你把分子结构式发过来大家研究一下。
一般先看结构式，如果没有什么特殊的基团（羧基、硼酸、氨基或者氨基类似的结构），分子结构中含N比较少，色谱柱先选AD-H，直接用90Hex：10IPA（或者EtOH）先试一下，时间长一点，保证把样品冲出来。保留时间长的话可以增大IPA（或者EtOH）的比例，保留时间短的话就降低IPA（或者EtOH）的比例。峰托尾时，如果含有酸性基团，试试加0.1％的三氟乙酸，含碱性基团试试加0.1％的DEA，含有氨基的也可以选择加甲基磺酸，比如说苯甘氨醇。有些既含酸又含碱的样品加酸或者加碱峰形都不好的话可以试试三氟乙酸和二乙胺同时加。
一般的样品都可以这样分开，还不行的话试试把IPA或者EtOH换为叔丁醇，也可以尝试叔丁醇与乙醇或者异丙醇混在一起用，通常都会有意想不到的分离效果。

楼上pandora 老师的解释近乎完美，句句皆是经验之谈 ，学习一下O(∩_∩)O~
狗尾续貂，补充一下：以盐形式存在的手性化合物与游离态的手性化合物，若采用同类型的手性柱的话，其分离操作是一样的，只要保证手性化合物盐能溶解即可。（比如，AD-H柱，手性化合物盐可以用无水乙醇、异丙醇等能溶）
大赛璐的手性柱，Chiralpak AD-H 和Chiralcel OD-H的分离功能是互补的，AD填料直链淀粉，OD纤维素，虽然他们都采用正相色谱模式。
个人觉得，Chiralpak AD-H 跟 Chiralcel OD-H组合，正相模式；Chiralpak AD-RH 跟 Chiralcel OD-RH组合，反相模式；他们两对内部之间分离互补。

能在AD-H上拆分开的话，在溶解度准许的情况下，在AD-RH上拆不分。个人觉得这很正常的啊，其实，他们就类似于正相色谱与反相色谱的选择性不一样一样。（偶没用过AD-RH，但在使用Chiralcel OD-H 和 Chiralcel OD-RH时，两者分离的化合物不一样，能同时在这两根色谱柱上分离的化合物还没有遇到，目前为止。个人瞎猜Chiralpak AD-RH 和Chiralpak AD-H的情况也类似 ）

谢谢两位老师的回答，对于成盐的化合物，经过你们的讲解我终于可以领会其精髓了，呵呵。在我实验中也成功拆分，真是非常感谢！！！

对于pandora老师的一段话，把手性拆分的整体思路表述的非常清楚！
对于其中有一些疑问，还希望得到您的继续帮助，

1." 直接用90Hex：10IPA（或者EtOH）先试一下，时间长一点，保证把样品冲出来。""一般的样品都可以这样分开，还不行的话试试把IPA或者EtOH换为叔丁醇，也可以尝试叔丁醇与乙醇或者异丙醇混在一起用，通常都会有意想不到的分离效果。"

通常先实验时是用EtOH还是IPA呢？哪个溶剂的选择性比较好？什么情况下转用叔丁醇或其和IPA or EtOH 的混合溶剂呢？
在我的实验中一般先用EtOH, 成功率还比较高。当使用EtOH时在这个色谱柱上有一定的分离趋势后，如果不能达到基线分离后在换IPA实验（基本上80%没有更好的分离效果），不知道我的思路是否正确。
另外对于两项醇混合溶剂的使用，我用的比较少，仅是在有两个手性中心的化合物中使用过（即总共四个化合物），使用混合溶剂是因为不同溶剂对某两个化合物的选择性不同，为了使四个化合物达到基线分离而选用醇混合溶剂。不知道pandora老师使用混合溶剂的思路以及解决什么样的问题？

2. 含有氨基的也可以选择加甲基磺酸，比如说苯甘氨醇。
含有氨基的化合物我加过TFA分离，有些会有很好的分离效果，有些则不然。但是加甲基磺酸我只在SFC中使用，担心的是他的酸性太强，在HPLC中使用对色谱柱寿命有影响。因此，还请pandora 老师对甲基磺酸的使用做一简单介绍。使用浓度范围是多少？另外我配制时好像0.1%的甲基磺酸的Hex溶液是浑浊的，不互溶。

3. 有些既含酸又含碱的样品加酸或者加碱峰形都不好的话可以试试三氟乙酸和二乙胺同时加。

三氟乙酸和二乙胺同时加，我在Daicel的柱子上也没有使用过（在CHIROBIOTIC柱子上用过酸碱都加），这里使用的是正相模式吗？一般比例和浓度是多少？分离得到的化合物的峰形如何？

以上问题还请pandora老师详述，我非常高兴能有行业前辈帮助我提高水平！！！

1." 直接用90Hex：10IPA（或者EtOH）先试一下，时间长一点，保证把样品冲出来。""一般的样品都可以这样分开，还不行的话试试把IPA或者EtOH换为叔丁醇，也可以尝试叔丁醇与乙醇或者异丙醇混在一起用，通常都会有意想不到的分离效果。"

a. 通常先实验时是用EtOH还是IPA呢？哪个溶剂的选择性比较好？什么情况下转用叔丁醇或其和IPA or EtOH 的混合溶剂呢？
  我个人喜欢开始先使用EtOH，没什么太特殊的原因，只是因为乙醇的味道可以接受，异丙醇太难闻，其实很多人更倾向于异丙醇，但是我实际操作中感觉两个各有千秋，不能说哪个比另一个更好。另外需要指出的是，正庚烷或者正己烷对分离度影响不大，有些样品用正庚烷分离度会稍微好一点，但不会有选择性上的差异，但是从人身健康的角度考虑正庚烷更好一点，价格上就要和正己烷差很多了。

b. 在我的实验中一般先用EtOH, 成功率还比较高。当使用EtOH时在这个色谱柱上有一定的分离趋势后，如果不能达到基线分离后在换IPA实验（基本上80%没有更好的分离效果），不知道我的思路是否正确。
  一般情况下，我认为只要有分离趋势，即说明你现在所选的EtOH或IPA对此样品有选择性，继续调整比例，通过减小EtOH或IPA的用量，延长分析时间，来增加样品的分离度，只要峰形没有问题，都能达到基线分离，当用乙醇或者异丙醇没有选择性，即完全没有分开的趋势的时候再去换另外一种试，如果乙醇和异丙醇都没有选择性的时候就可以试试叔丁醇。如果两峰保留时间差足够大，但峰形不好，就需要加酸和碱来调峰形，相同的保留时间，如果半峰宽或者峰宽变小，分离度自然也就变好了。

c. 另外对于两项醇混合溶剂的使用，我用的比较少，仅是在有两个手性中心的化合物中使用过（即总共四个化合物），使用混合溶剂是因为不同溶剂对某两个化合物的选择性不同，为了使四个化合物达到基线分离而选用醇混合溶剂。不知道pandora老师使用混合溶剂的思路以及解决什么样的问题？
    一般我用叔丁醇的时候喜欢往乙醇或异丙醇里加入少量叔丁醇，有时候一个样品用乙醇没有选择性，但是保留时间很短，但是用异丙醇分离度非常高，90：10的比例相差二三十分钟的时候也有，如果增加异丙醇的比例很多的话，压力会变得很高，这时候我就需要在异丙醇里加入乙醇降低分离度，也有复杂成分的样品，需要同时加入两种或者更多的溶剂来做分离，用IC的色谱柱我试过加入乙醇、叔丁醇、二氯甲烷和正己烷做流动相，因为样品只有在二氯甲烷中溶解，所以有时候发现有分离的趋势但是无论如何峰形不好，需要检查一下样品在流动相里的溶解性。手性做多了，经常是分样品的时候看手头有哪个常用比例的流动相就直接拿来用了。还有一点就是样品稀释的问题，尽量用醇含量和流动相一致或者少一些的溶剂来稀释样品，我曾经做过一个样品，只能用正己烷稀释，只要加入醇就不能达到基线分离。

2. 含有氨基的也可以选择加甲基磺酸，比如说苯甘氨醇。
含有氨基的化合物我加过TFA分离，有些会有很好的分离效果，有些则不然。但是加甲基磺酸我只在SFC中使用，担心的是他的酸性太强，在HPLC中使用对色谱柱寿命有影响。因此，还请pandora 老师对甲基磺酸的使用做一简单介绍。使用浓度范围是多少？另外我配制时好像0.1%的甲基磺酸的Hex溶液是浑浊的，不互溶。
    加入甲基磺酸是将样品里的氨基衍生，一般苄胺结构的氨基峰形都很差，必须加甲基磺酸或者二乙胺之类的添加剂，一般认为二乙胺在柱子上残留很严重，而且在低波长下背景吸收很大，噪音很高，降低灵敏度，对定量有影响，像苯甘氨酸我就喜欢用甲基磺酸，或者说类似的氨基酸结构都可以这样考虑。甲基磺酸、三氟乙酸、二乙胺、三乙胺用到0.1％的浓度都没有什么问题，大赛璐的网站上都有相关介绍，但是有时候一个样品中性原来能做的很好，但是色谱柱用过甲基磺酸、三氟乙酸或者二乙胺、三乙胺以后，柱子里残留的这些酸碱很难用中性洗掉，会对样品有很大影响，直接导致原来的样品不能成峰，如果是原来有碱残留，可以在溶剂里加酸，反之亦然。我用流动相都是先混合好在一个瓶里，因为有时候感觉机器混的不好，且更换流动相比例时平衡时间太长，所以不会有混浊的问题。
3. 有些既含酸又含碱的样品加酸或者加碱峰形都不好的话可以试试三氟乙酸和二乙胺同时加。

三氟乙酸和二乙胺同时加，我在Daicel的柱子上也没有使用过（在CHIROBIOTIC柱子上用过酸碱都加），这里使用的是正相模式吗？一般比例和浓度是多少？分离得到的化合物的峰形如何？

    这个我是做了一个含有多个羧基和N结构的杂环样品，无论加酸加碱都不能将其分离，最后同时加入酸和碱，都是0.1％含量，结果样品分离很好，峰形也很完美。还有些样品必须加二乙胺，但是加入以后和没有加之前相比，相同浓度和进样量，峰高由原来的200多变为40，基线也很差，我将方法改为样品稀释时加二乙胺（加入量自己试），流动相用中性，两个手性中心的样品分离效果很好。
    还见过一些老外提供给我们的分析方法，流动相配制时加入0.1％或者0.05％左右的水，来增加分离度，但是我没有用过，这些方法后来我都给改了。基本上我都是用正相做手性分离，几年来遇到的手性样品几乎是都能分开，除了有些样品溶解性的问题，一般只要样品在流动相里能溶解，就能分离。
    说来说去，分手性最重要的还是动手去试。

感谢pandora如此详细的回答，非常全面，对我非常有有帮助！！！

还请问您是做什么行业的？？医药吗？是不是一般手性化合物的拆分都是医药行业的？：）

我是做HPLC分析的，公司是做医药中间体的，现在手性化合物差不多都是做药的