小中大有对RT、PCR问题感兴趣的筒子们吗？欢迎参与哈
笨人今日开帖,有定量PCR相关的问题可以提问,
如果有类似/雷同的问题~~~~~~·实属巧合~~~~··哈哈！
现将收集到的每一页的主要问题整理一下哈~~~~~~~~
Page1：
1.做目的基因表达量分析的简易小流程。
2.什么样的实验数据才是可靠的呢？
Page2：
1.多重PCR与单一PCR仅仅是引物探针设计上的差别吗？
2.选择绝对定量还是相对定量？
3.如何判断体系的阴性对照是否有污染？
4.溶解温度曲线是如何制作的？
Page3：
1. 定量引物与普通引物的设计差异。
2.如何稀释标准品。
Page4：
1.相关系数与斜率的意义。
2.- △△CT法与标准曲线法的比较。
Page6：
1.反转录前应将totalRNA调整的统一且适当的浓度。
2.模板、preMix均不建议用振荡器混匀。
Page7：
1.total RNA无法电泳以及测OD
2.溶解温度曲线有两个峰怎么办？
Page8：
1.一步法试剂盒与两步法选择上有什么差别？
2.cDNA不能测OD。
Page9：
1.△△CT法要求的扩增效率
2.阈值的民间调整法
3.溶解温度曲线的制作过程
Page10：
PCR反应时模板添加量
Page11：
商品化的premix，只选适合自己的。
简单说一下做定量PCR的流程(以RNA起始为例):
1.提取total RNA
针对不同的组织选择不同的试剂盒提取total RNA,尽量严格按照试剂说明书的要求来进行.
提取过后,需要对totalRNA进行质量测定,包括两个部分,一个是1%琼脂糖胶电泳,确定是否降解,一般来说动物组织来源的质量好的total RNA电泳有三条带,28s为最亮,理想情况下接近18s亮度的2倍,5.8s最弱,只是很模糊的一条带;某些植物组织有4条带。并且，如果在电泳前能将total RNA变性一下，跑出来的图片会更漂亮，28S上面是比较干净的。另一方面是测OD,通过OD计算出totalRNA的浓度.一般来说total RNA OD260/280的范围在1.8-2.2之间,都是比较好的.230代表盐离子浓度,260核酸,280蛋白,320背景浑浊度.
2.将total RNA的浓度调至统一的起始量.
计算total RNA的浓度:RNA浓度（μg/μL）=（A260-A320）X稀释倍数X 0.04根据您所选择的反转录(RT)试剂,以及定量PCR试剂对模板浓度的要求,用DEPC处理水把total RNA稀释至统一的浓度.
3.RT&PCR
这两个步骤没什么可说的,按照说明书来做就行.值得注意的是,要尽量避免污染,有条件的话,模板添加区和混合液配置区分开,枪,枪头,tube,什么的全部都分开.实在不行,也要用70%酒精把枪都擦一遍再用.
以上仅仅是个protocol,还有很多细节,待遇到了再详细说.
[ 本帖最后由 阿拉蕾 于 2011-8-10 17:50 编辑 ]
