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我最近刚好也做了这样的试验，严格说应该叫做重组PCR。前些天测序后已经证明两个片断已经通过18bp的街头连在一起。
根据我的经验，我建议楼主这样做：
1.关于四条引物的设计：
a. csa上游：楼主的引物应该没问题。
b. 下游csa：从5到3依次为：街头＋CSA下游。关于街头长度，18bp已经够用了，楼主用了24个bp也没有问题；CSA下游引物楼主短了点，17个bp也可以，最好在20bp以上。
c. IFNa上游: 从5到3依次为：街头＋IFNa上游。IFNa上游引物楼主短了点，最好在20bp以上。
d. IFNa下游: 没有问题
2.关于PCR, 我建议楼主这样做：
a. 先分别扩出CSA和IFN的目的片断。胶回收。25cycles
b. 重组PCR楼主可以有两种方法：
1.将回收的两个片断，分别取5-10ul，加上其他PCR组分至30ul，注意不加任何引物。PCR 10 cycles。然后取5-10ul上述PCR的产物，加PCR组分至30ul，注意加入csa上游和IFNa下游引物。30 cycles.
2. 也可以把第一种方法两个PCR反应一起做，即直接在第一个PCR反应中加入引物。30cycles。两个方法我都能扩出目的片断。
3.关于酶：我用的是KOD plus， toyobo公司的。楼主的这个酶会有A加入，建议换。
楼主要先把两个目的片断扩出来。如果楼主两个片断已经分别克隆到载体上，两个片断第二轮PCR时连不上，我建议楼主可以把csa上游引物和 IFN下游引物分别设计两个，一个用载体的序列，一个用目的片断的，这样先用载体引物扩出目的片断，回收，然后再用片断引物作重组PCR，有点类似套式PCR。
好运！
