PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】荧光定量PCR的CT值太高

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 16  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】荧光定量PCR的CT值太高

铜雀[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76992
精华 0
积分 344
帖子 365
信誉分 101
可用分 2611
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
1

发表于 2015-7-3 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光定量PCR的CT值太高

小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！ 我先后做过以下调整：
1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化
2、增加引物浓度，做了一个梯度，发现变化也不大
3、怀疑是逆转录试剂盒不行，换了另一个进口试剂盒（promega）还是老样子
4、重新测了一下提取的RNA，浓度和纯度都可以（A260/280=1.9左右
5、引物blast了，很好。溶解曲线也是单峰，Tm在90左右。
6、操作应该不会有什么大的失误
现在实在不知道哪里出了问题。。。。求各位高手帮我想想是哪里出了问题
我的体系如下：10ul 染料（Go Taq Mix，promage公司）、2ul cDNA（不稀释）、上下游引物各0.4ul、补水至20ul
顶部
铜雀[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76992
精华 0
积分 344
帖子 365
信誉分 101
可用分 2611
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
2

发表于 2015-7-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

发现一个问题，溶解曲线虽然是单峰，但是纵坐标的Rn的值很高，别人的都是小于0.1，我的1-5. 是不是这个原因啊？
顶部
langlang[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
3

发表于 2015-7-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？
建议换一对引物。
顶部
铜雀[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76992
精华 0
积分 344
帖子 365
信誉分 101
可用分 2611
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
4

发表于 2015-7-3 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 langlang 于 2015-7-3 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你actin的产物预计是多少bp？跑过胶看看没？
建议换一对引物。

好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧
顶部
shkudo[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114490
精华 0
积分 305
帖子 309
信誉分 100
可用分 2338
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
5

发表于 2015-7-3 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 铜雀 于 2015-7-3 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

好像是200 bp左右，没有跑过胶，我试试看吧

200bp对于Real-time PCR太大了，一般来说是几十个bp最合适。个人认为还是引物的问题。
另外不排除RNA提取过程和逆转录过程中DNA的污染，建议先用DNAse处理后再进行逆转录。
顶部
daod[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76758
精华 0
积分 585
帖子 790
信誉分 100
可用分 4891
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
6

发表于 2015-7-3 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 铜雀 于 2015-7-3 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
小弟最近在做荧光定量PCR，发现无论是actin还是目的基因的CT值都很高（30多），目的基因30多也就罢了，actin不会这么高啊！ 我先后做过以下调整：
1、增加模板浓度，稀释10倍、5倍、2倍，不稀释的都试过，没有什么质的变化
2、增加引物浓 ...

建议先进行普通的PCR，用actin鉴定模板的质量。循环数设在22-26之间，跑胶后，看ACTIN的表达情况，再分析原因。
顶部
luoliqiong[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108876
精华 1
积分 443
帖子 482
信誉分 102
可用分 3053
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
7

发表于 2015-7-3 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先做半定量来检验一下引物和体系，其次定量需要对模板进行稀释（以10的指数）做标曲。引物长度不是问题，片段短当然更好。纵坐标的阈值是可以手动调节的，有个计算公式。国产和进口试剂的阈值是不同的
顶部
whitesheep[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78856
精华 0
积分 825
帖子 1330
信誉分 100
可用分 7476
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-4
状态 离线
8

发表于 2015-7-3 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天跑了一次胶，如上图所见。前两道是actin，后四道是目的基因。95度15秒，60度1分钟，四十个循环。
个人感觉cDNA模板和引物应该没有问题。难道是荧光定量PCR的机器坏了？我用的是AB7500.
各位大侠实验室的荧光定量PCR机器多长时间维修一次？


查看积分策略说明
附件
2015-7-3 11:11
68476585.jpg (26.54 KB)
 
顶部
ns5fan[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114518
精华 1
积分 416
帖子 510
信誉分 101
可用分 3353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
9

发表于 2015-7-3 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？
顶部
铜雀[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76992
精华 0
积分 344
帖子 365
信誉分 101
可用分 2611
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
10

发表于 2015-7-3 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ns5fan 于 2015-7-3 11:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
好像是引物的问题，请重新设定引物看看，呵呵！第6和第7到RT-PCR的CT值和其他两个有区别吗？

第六和第七道我没有加样啊。请问是如何看出引物有问题呢？
顶部
 16  1/2 12››