小中大电泳图的阅读体会-(心得)初学者必读 [转自 丁香园论坛]
惭愧,电泳后出现异常情况,最后发现系配错胶浓度,才算有点真正理解琼脂糖凝胶电泳!或者说真正看懂书,可惜这些细节就是没人教,可能就是所谓的个人领会。在这里共享,以助初学者理解。唉,本来做实验就不是专业,这几个月一边做一边学。真希望能看到高手的体会、分享。但反过来想想,要是我很懂了,可能会以为这些很简单大家都懂,也不会发帖提醒。所以在这里慢慢总结这次错误。自己思考,也希望多少对大家有帮助。
基本概念(出现错误后才真正能理论联系实际)
溴化乙锭(EB)是制胶时混在胶中,载样缓冲液(含溴酚蓝染料)是电泳前才同样本混合的。
正确电泳后拍的照片,仔细观察可以发现,点样孔侧(阴极)较白,而另一侧则较黑,两者之间有一分界线。其实显示白色的胶内含EB,而黑色的胶内则EB已迁移,所以EB是胶呈白色的原因。此分界线为EB在电场作用下向阴极移动的前沿。分界线的点样孔侧有一排黑色条带,只有在点过样本的点样孔列出现,无样本的列则无此黑色条带。此黑色条带为溴酚蓝在照片中的位置。
电泳时,点样孔侧通常为阴极,而对侧则为阳极。蛋白带负电荷,所以向阳极移动,溴酚蓝也带负电荷,同样向阳极移动。溴酚蓝在不同浓度的胶内的移动速度是不同的。在0.5-1.4%浓度、0.5 X TBE的胶内其移动速率约与300bp的线状双链DNA相似。但我用的胶是3%,所以与书上不同,与更小bp的线状双链DNA相似。胶内的EB带正电荷,向阴极也就是点样孔侧移动。溴酚蓝是在电泳时起到指示电泳带的作用,就是肉眼在胶上看到时的染色条带,而EB与DNA结合才是在紫外线下发光的原因。如果电泳时间过长,会导致EB向阴极移动过多,甚至全部跑出凝胶。这样的话,含样本条带的胶内没有EB,在紫外线下电泳条带就不能发光。
错误就这样发生了,配错胶浓度,可能是1.5%,导致在同以前一样的电泳时间内,条带跑得更远,跑到EB已经向阴极移走,所以不含或含很少EB的胶内,于是在紫外线下看不到条带。
这时想要补救,以显示条带,就需要在含0.5ug/ml溴化乙锭(EB)液中浸泡约30-45分钟。