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标题:PCR污染严重，急找原因[转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-13 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PCR污染严重，急找原因[转自 丁香园论坛]

PCR污染严重，急找原因 [转自 丁香园论坛]


请问各位高手，我的最近的PCR经常污染，空白对照管也能跑出亮亮的目的条带，但是所有的原材料（水，buffer.mg,dntp,引物，酶）都是新的，匪夷所思，实在找不出原因来了，而且枪也没有混用，请大家支支招，还有哪些可能的污染的地方啊？谢谢！（TAQ酶用过几次了，它不会污染吧？每次只加0.2ul而已啊）
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发表于 2011-8-13 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
换一个以前没有做过该实验的地方，最好是通风的地方。把所有的枪头盒与枪都用75%乙醇或84消毒液擦一遍，尤其是枪管内部要冲洗干净（最好再用高压湿热灭菌），再放到超净台内紫外照射30分钟。所有PCR相关试剂全部换掉，操作前用肥皂洗手，带上手套，帽子，口罩。
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发表于 2011-8-13 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近处理一个售后问题，也是PCR污染的问题，最终确定是PCR产物污染了引物。污染的来源可能是使用加样器的不良习惯，如下图：使用10-20ul枪头，在1.5ml离心管里吸取试剂时，红色标记的区域接触到管内壁造成污染。

去除DNA污染可以用酸水解和高温水解，紫外形成嘧啶二聚体对PCR不是很有效。

酸水解：用稀盐酸，1%左右就够了，泡半个小时后擦干。强酸性条件下DNA很容易水解。

高温水解：PCR仪，95-100度空运行半小时；加样器如果可以高压灭菌就常规灭菌。高温下DNA容易断裂并水解。

另外，吸取0.2ul这样的体积任何加样器都是不准确的，因为枪头外沾的和枪头内挂的体积足够影响实验的重复性了。


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发表于 2011-8-13 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问枪管内部怎么洗啊？EPPENDORF的枪可以高压高温么？枪的问题还是比较纠结，安全起见，我就直接拿到紫外下面照去了，请问有效吗？谢谢！
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发表于 2011-8-13 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问问可以直接把枪放到酸里浸泡吗？直接擦一擦不行吗？引物和dNTP也有可能污染，越想越觉得可能是枪的问题，直接紫外照射管用吗？
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发表于 2011-8-13 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Taq酶也可能污染的。
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发表于 2011-8-13 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
整个枪当然不能泡 。在1.5ml离心管中装上稀盐酸，把枪前面的部分泡在酸里。
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发表于 2011-8-13 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
枪也经过处理了，试剂 也都是新的，以前怀疑可能污染的对象引物和dNTP也都是换的新的，并且在新地方操作，不知道为什么空白水里还是能跑出目的条带，请各位高手再给点建议吧，太急人了！
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发表于 2011-8-13 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
挨个找原因吧，好像Taq还没检查过。

另外还有两个问题：

1. 目的片段多大，如果小于100bp，也有可能是dimer，如果引物二级结构复杂，形成的dimer不一定是两个引物加起来那么长，也有可能会超过100bp。如果不确定，就把引物序列和电泳图片晒上来看看。

2. 目的基因是什么，如果是细菌的16S RNA或者质粒通用序列，那么也有可能是Taq酶本身的污染，因为目前市场上的Taq酶绝大多数都是原核表达，可能会有细菌基因组DNA和表达载体质粒DNA的污染。
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 小中大
很多实验室其实条件很差，但一直都在做PCR，目前大多数PCR污染都是环境中的PCR气溶胶造成的。
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