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标题:手把手教你在线做PCR引物设计，不需要下载任何软件

米米[使用道具]
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发表于 2011-8-19 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

手把手教你在线做PCR引物设计，不需要下载任何软件

手把手教你在线做PCR引物设计，不需要下载任何软件 [转自 丁香园论坛]


前言：很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。

开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对PCR目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：
第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是cuturl('http://frodo.wi.mit.edu/')。
第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里有图）在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。
第三步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望软件给你随便做的话，首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500，具体看情况调整。第二个参数是“Primer Size”，默认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”Primer Tm”这个和Primer Size差不多。
第四步：Pick primers： 点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信息，包括位置，长度，Tm，GC含量，任何位置互补碱基数，3'端互补碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。
比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：
WARNING: Left primer is unacceptable: High 3' stability
OLIGO start len tm gc% any 3' seq
LEFT PRIMER 1 33 69.02 45.45 6.00 1.00 TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC
RIGHT PRIMER 1388 34 67.86 29.41 6.00 2.00 AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT
SEQUENCE SIZE: 1388
INCLUDED REGION SIZE: 1388
PRODUCT SIZE: 1388, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 3.00
第五步：引物设计检验：可以仅仅设计一向引物，只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是5'->3'）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽空另做说明。
至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR一次成功，也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.

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发表于 2011-8-19 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这一段时间也在做PCR ，引物序列是文献上的 但是就是有的扩不出来 可以验证一下了
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发表于 2011-8-19 14:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢了，我会验证下，最近做PCR结果老出不来，急死了
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发表于 2011-8-19 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢分享 又学到一招 不过还是觉得oligo比较好 哈
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发表于 2011-8-19 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这样做处的不是太严禁啊！希望详细的
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发表于 2011-8-19 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个网站是不错，但是我上次照这个上面设计的8对引物有3对都做不出来。
我觉得还是primer bank好些，这个里头的引物都能做出来。

cuturl('http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/')
网址是这个，不过这个针对的是对已知基因，而不是目的序列
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发表于 2011-8-19 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以后可以试一试，多谢了。
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发表于 2011-8-19 15:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很有用的东东！支持原创，谢谢分享。
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爱哭鬼[使用道具]
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发表于 2011-8-19 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这个警告是什么意思哦？我看不懂，可不可以指点下？谢谢了

Primer3 Output

--------------------------------------------------------------------------------

WARNING: Numbers in input sequence were deleted.

Using mispriming library rodent_ref.txt
Using 1-based sequence positions
OLIGO start len tm gc% any 3' rep seq
LEFT PRIMER 590 20 60.11 50.00 4.00 2.00 11.00 aggacatggagcaagtttgg
RIGHT PRIMER 1089 20 60.12 50.00 7.00 2.00 9.00 gttcagtgaaatgccggagt
SEQUENCE SIZE: 1980
INCLUDED REGION SIZE: 1980

PRODUCT SIZE: 500, PAIR ANY COMPL: 3.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

1 gccgccgcctcacctctgctgccagtagcctcgccgtcggggagccctagcgcagcgtcc


61 gccctcagcatgatggacttggaattgccaccgccaggactacagtcccagcaggacatg


121 gatttgattgacatcctttggaggcaagacatagatcttggggtaagtcgagaagtgttt


181 gactttagtcagcgacagaaggattatgagctggaaaaacagaaaaaactcgaaaaggag


241 agacaagagcaactccagaaggaacaggagaaggcctttttcgctcagttacaactggat


301 gaagagaccggagaattcctcccaattcagccagcccagcacatccagacagacaccagt


361 ggatctgtcagctactcccaggttgcccacattcccaaacaagatgccttgtactttgaa


421 gactgtatgcagcttttggcagagacattcccatttgtagatgaccatgagtcgcttgcc


481 ctggatattcccagccacgttgagagctcagtcttcaccacccctgatcaggctcagtca


541 ctcgatagctctctggagacggccatgactgatttaagcagcatacagcaggacatggag
>>>>>>>>>>>

601 caagtttggcaggagctattttccattcccgagttacagtgtcttaatacggaaaacaag
>>>>>>>>>

661 cagcaggctgagactaccactgtccccagcccagaggccacactgacagagatggacagc


721 aattaccatttttactcatcgatcccctcactggaaaaagaagtggacagctgtagtcca


781 catttccttcatggttttgaggattcttttagcagcatcctctccacggatgatgccagc


841 cagctgaactccttagactcaaatcccaccttgaacacagatttcggtgatgaattttac


901 tctgctttcctagcagagcccagtggcggtggcagcatgccttcctctgctgccattagt


961 cagtcgctctctgaacttctgggcgggcccattgagggctgtgatctgtccctgtgtaaa


1021 gctttcaaccagaagcacactgaaggcacggtggagttcaatgactctgactccggcatt
<<<<<<<<<<<

1081 tcactgaacacaagtcccagccgagcatccccagagcactctgtggagtcttccatttac
<<<<<<<<<

1141 ggagacccaccgcctgggttcagtgactcggaaatggaagagctagacagtgcccctgga


1201 agtgtcaaacagaatggacctaaagcacagccaacacattcttctggggatacagtacag


1261 cctctgtcgccagctcaagggcacagtgctgctgtgcacgaatcccagtgtgaaaataca


1321 acaaaaaaagaagtacctgtgagtcctggtcatcaaaaagtcccattcacaaaagacaaa


1381 cattcaagccgattagaggctcatctcacaagagatgagcttagggcaaaagctctccat


1441 attccattccctgttgaaaaaatcattaatctccctgttgatgacttcaatgaaatgatg


1501 tccaaggagcaattcaacgaagctcagcttgcattaattcgagatatacgcaggagaggg


1561 aagaataaagttgccgctcagaactgtaggaaaaggaagctggaaaacattgtagagctg


1621 gagcaagacttgggccacttaaaagacgagagagaaaaactactcagagaaaagggagaa


1681 aacgacagaaacctccatcttctgaaaagaaaactcagcactttgtatctggaagtcttc


1741 agcatgttacgtgatgaggatgggaaaccttactctcccagtgagtactctctgcagcag


1801 accagagatggcaacgtgttccttgttcccaagagcaagaagccagatacaaagaaaaac


1861 taggttcgggaggatggagccttttctgagctagtgtttgttttgtacggctaaaacttc


1921 ctactgtgatgtgaaatgcagaaacactttataagtaactatgcagaattatagccaaag


KEYS (in order of precedence):
>>>>>> left primer
<<<<<< right primer

ADDITIONAL OLIGOS
start len tm gc% any 3' rep seq

1 LEFT PRIMER 65 20 60.20 45.00 6.00 2.00 11.00 tcagcatgatggacttggaa
RIGHT PRIMER 528 20 59.96 55.00 3.00 1.00 10.00 atcaggggtggtgaagactg
PRODUCT SIZE: 464, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00

2 LEFT PRIMER 64 20 59.79 50.00 6.00 0.00 10.00 ctcagcatgatggacttgga
RIGHT PRIMER 528 20 59.96 55.00 3.00 1.00 10.00 atcaggggtggtgaagactg
PRODUCT SIZE: 465, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 0.00

3 LEFT PRIMER 1183 20 59.86 60.00 5.00 1.00 11.00 ctagacagtgcccctggaag
RIGHT PRIMER 1641 20 59.88 50.00 7.00 3.00 9.00 taagtggcccaagtcttgct
PRODUCT SIZE: 459, PAIR ANY COMPL: 5.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

4 LEFT PRIMER 599 20 60.15 50.00 4.00 2.00 10.00 agcaagtttggcaggagcta
RIGHT PRIMER 1089 20 60.12 50.00 7.00 2.00 9.00 gttcagtgaaatgccggagt
PRODUCT SIZE: 491, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

Statistics
con too in in no tm tm high high high high
sid many tar excl bad GC too too any 3' lib poly end
ered Ns get reg GC% clamp low high compl compl sim X stab ok
Left 12988 0 0 0 34 0 3223 6084 0 16 0 66 240 3324
Right 13392 0 0 0 20 0 4053 5288 1 3 0 42 219 3765
Pair Stats:
considered 1605, unacceptable product size 1590, ok 15
primer3 release 1.1.0

(primer3_results.cgi 0.4.0 modified for WI)  
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竹蜻蜓[使用道具]
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具体怎么验证用这个软件出来的引物呢 楼主有时间在给我们讲一下吧
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