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标题:【求助】这个坎啊，怎么过？ [转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-19 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】这个坎啊，怎么过？ [转自 丁香园论坛]

【求助】这个坎啊，怎么过？ [转自 丁香园论坛]


折腾荧光定量已经一个月了，改变引物，改变温度，改变模板浓度，荧光定量总是没有产物。

我的目的基因1万多个bp,荧光定量产物大概200bp,我在想是不是提RNA过程中基因
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发表于 2011-8-19 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
折腾荧光定量已经一个月了，改变引物，改变温度，改变模板浓度，荧光定量总是没有产物。

我的目的基因1万多个bp,荧光定量产物大概200bp,我在想是不是提RNA过程中基因发生断裂，或者RNA结构太复杂，导致总没有结果，有没有战友做过这么长片段的RT-PCR的，有的话您吱一声。。。和短片段的RT-PCR有什么区别吗？
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发表于 2011-8-19 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在普通PCR上跑也没有产物？换个反转的酶？

不过我们用MLV也用得很欢畅啊``````
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发表于 2011-8-19 16:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你有没有用普通PCR试一下？

扩增长片段时可以试着加一些DMSO、BSA、甜菜碱
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发表于 2011-8-19 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不会，我很多基因都这么大。没扩出来有以下几个原因：1.引物设计问题，有没有跨外显子？2.反转录体系对qPCR反应有抑制，你设计的产物片段挺长的，可以用普通pcr扩一下，如果能扩出来，说明体系存在抑制物，按倍比稀释做一个qPCR扩增效率 找到合适的cDNA浓度。3.引物或qPCR试剂过期。可以扩增一下阳性对照如果能出来说明qpcr试剂没问题。引物可以用5%的琼脂糖凝胶跑一下看看。  
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 小中大
1 为了避免基因组的干扰，设计的引物是跨内含子的，这对结果有很大影响吗？

2 普通PCR试过，没有条带，倍比稀释的没做过，我想可以试试

3 阳性对照做过，试剂没问题

我想再请教下，你们用的是什么逆转酶？
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发表于 2011-8-19 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你们用的是什么逆转酶？
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发表于 2011-8-19 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
以上试剂的作用是？加入多少量呢？
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发表于 2011-8-19 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因大小不影响你扩增的 你的扩增片段只有200bp
你试验目的不知是什么 如果只是检测目的基因的量 扩增片段可以设计的更小一些
另外 没有扩增产物 可能有很多原因 引物 PCR条件 模板质量 浓度 等等
可以设计特定的实验 检验一下这几个环节
这样可以避免做无谓的时间精力浪费
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 小中大
目的基因太长啦 ~~~
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