小中大RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自 丁香园论坛]
RT-PCR摸索条件个人经验总结[转自 丁香园论坛]
个人感觉做RT-PCR重要性排序:排第一的是引物,第二的是退火温度,第三才是模板.
(1)引物
引物可以自己设计或者参考自名牌期刊如5分以上的或本专业排名前四的期刊.因为这发表在这些期刊上文章的作者没有必要在方法学上造假,所以他们提供的引物序列是可信的.建议大家针对同一基因设计或者查找2对不同引物序列,合成一对引物时最好找2家不同的生物公司合成此物,如英俊(invitrogen),上海生工等.具体原因是,引物合成不可避免有一定的错误率,国际上公认的是0.3%到0.5%,在中国大陆的生物公司由于偷工减料,错误率更有可能达到1%！既然我们选择了化学合成法合成引物,就要承担这个错误率.这就好比青霉素是治疗感染的好药,既便宜又管用,但只要注射青霉素,就存在过敏性休克的可能性.但2家不同的生物公司合成同一对引物出错的概率那几乎可以说是0了,这就是为什么要找2家生物公司合成引物的原因节省了时间,加快了实验进度,表面上看浪费了钱,考虑摸索条件时其它试剂的开销其实节省了钱,总的来说既节省了钱又节省了时间.
(2)退火温度
若有梯度PCR仪摸索条件方便多了，一次可以摸索10个退火温度，一天就能摸索好条件，若一种引物摸索了10个退火温度还没有看见目的条带的话，那应该果断地放弃这个引物，采用其它引物,千万不要在一条引物上吊死,那样会浪费很多时间和金钱，那怕它的序列出自于nautre,science,原因可能是引物合成时的突变。我一般采用的反应如下
10X Taq buffer 5ul
10mM dNTP 1ul
25mM MgCl2 3ul
Taq酶(1u/ul) 1ul
正义引物 1.5ul
反义引物 1.5ul
模板 2ul
超纯水 35ul
本人用的试剂除了引物、dNTP外全部是fermentas(MBI)品牌的，原因很简单，fermentas(MBI)质量很好，价格又便宜，500U的Taq酶才卖130元，和国产试剂差不多，但发文章尤其是SCI期刊时写fermentas(MBI)的名字很有面子的；引物是英俊(invitrogen)合成的；dNTP是promega品牌大陆分装的，很便宜1 ml 的10mM dNTP才130元 。10X Taq buffer我一般用fermentas(MBI) Taq酶(货号EP0404，cuturl('http://www.fermentas.com/catalog/modifyingenzymes/taqdnapolymeraserecomb.htm'))附带的硫酸铵((NH4)2SO4)，氯化钾没有用过。
预变性94度3分钟;然后变性94度30 秒，退火做从50度到60度的10个梯度30秒，延伸72度45秒共35个循环;最后总延伸72度10分钟。摸索条件时一般用8ul产物上样电泳。
只要有目的条带可以说就已经成功了90%，至于什么引物二聚体，非特异性扩增，可以通过调整引物的量、模板的量、镁离子来解决。若没有目的条带，调整引物的量、模板的量、镁离子纯属瞎闹。
(3)模板
提取总RNA和逆转录时大家只要严格按照试剂盒的说明书操作就行了，没什么技巧。提取总RNA我用英俊(invitrogen)的Trizol，量一定要够。逆转录我用fermentas(MBI)的逆转录试剂盒(RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit,cuturl('http://www.fermentas.com/catalog/kits/kitrevertftstrand.htm'))，货号K1622，很好用，加好样后，按42度60分钟、70度5分钟反应就行了。这个试剂盒还提供了一对人、大鼠、小鼠通用的GAPDH内参，496bp，58度退火温度。序列如下：
正义5-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3
反义5-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3
注：本人提到的上述品牌绝对不是在给该品牌打广告，而是本人亲自使用该品牌产品后的心得，该品牌也没有向本人提供任何赞助。
