针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛]

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标题:针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛]

蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2011-8-20 12:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

针对外显子设计PCR测序引物教程[转自丁香园论坛]

在园子搜索后，没有看到长基因（大与1000base)最简洁方法，而我现在欧洲实验室里从事这方面工作，作了大量这方面的工作。自乐不如同乐，愿将我们设计引物技巧与大家分享，敲字很辛苦，请斑竹给点分。
可能有战友说了，我们的长基因都是交给测序公司用鸟枪法来测全基因的。当然，您有钱当然可以这样做。我们的方法适用于基因测序筛查突变，步骤相对简便，比较经济。另外，本实验室最近的一偏文章采用该法发在了NEMJ上，可见该法已经是经典成熟的。
（1）基础知识
我们知道gDNA由非编码区，外显子，内含子构成。我们关心的基因是否突变在非编码区，外显字以及临近外显子的一小段内含子上。至于其他的内含子（gDNA中的大头），发生突变与否并不是我们关心的，其临床意义也相当小。因此我们只要设计引物来PCR上面三个重点区域就可以了。
（2）设计软件
在线设计软件 exon primer
cuturl('http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/ExonPrimer.html')

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2011-8-20 12:13

86599152_snap.jpg (47.63 KB)

蓝蜗牛[使用道具]
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发表于 2011-8-20 12:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家从上图可以看到，网页提示我们现在需要输入两个序列，一个是cDNA，一个是gDNA。
由于我们还要考虑非编码区，而CDNA是没有非编码区UTR的。因此，我们必须要用mRNA 输入网页中的cDNA栏。否则我们得到的引物不会包含UTR。要是有看官还看不懂的话，建议看下分子生物学教材关于cDNA和mRNA的区别。
下面我们以smurf2基因来说明如何设计针对外显子的测序引物。
（2）找到smurf2 mRNA
打开gene bank
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/'),注意要在database中选nucleotide
如下图

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2011-8-20 12:14

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