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标题:求助关于甲基化PCR的问题 [转自 丁香园论坛]

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求助关于甲基化PCR的问题 [转自 丁香园论坛]

求助关于甲基化PCR的问题 [转自 丁香园论坛]


各位老师好!

我是一个MSP初学者,刚开始实验遇到了很多问题,很苦恼,望前辈们工作之余垂阅指导,不胜感激!
我是要做石蜡包埋组织的dna启动子区域甲基化检测。上周自己按照试剂盒进行第一次摸索试验,因为没有专门的老师指导,所以结果可想而知,最终maker的条带很清晰,而样品区域没有任何条带。以下是我自己分析的试验中可能出现的问题,希望前辈能指导一下,看看问题出在哪里了,万分感谢!
1、选取的是卵巢癌石蜡标本(切片),切片的厚度是10微米,之前每个样品切了大约十几片,装在EP管里,本次试验每个样品取了30毫克(石蜡和组织的总重量)。
2、提取dna的试剂盒是上海生工的柱式提取试剂盒,里面的蛋白酶K没有要求放在冰箱保存,我就放在常温保存的(说明书上说常温可以保存半年以上),按说明书每个样本加进去20微升,56度水浴一小时只溶解了一部分,我又加了20微升蛋白酶K并进行水浴一段时间,完全溶解。提取dna的最后一步从离心柱上洗脱,我共重复了三次,共加进去洗脱液330微升,最终的dna溶液即330微升,存于-20度保存。(是不是加的洗脱液太多了,dna浓度太低?)
3、修饰过程和MSP使用的试剂盒是QIAGEN公司的试剂盒,是全英文的,自己翻译的,应该步骤没有少做。修饰过程中觉得亚硫酸氢盐粉末挺难溶解的,修饰时从上面330微升的dna溶液中取了5微升(是不是取太少了,试剂盒要求进行此步的dna量的范围是2纳克到2微克),最后从离心柱上洗脱dna时重复了两次,用了40微升的洗脱液,此时得到的dna溶液为40微升。
3、最后进行MSP时取了每个样品dna取了5微升,凝胶电泳时maker条带很清晰,其余区域什么也没有,连他们说的引物二聚体也没有。
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4、引物是从国外文献上拷贝下来的,国内有人在其他组织中做过MSP,引物序列和国外文献一样。引物是由上海生工合成的,溶解是用的TE缓冲液,然后分装,放在-20度保存。
5、查找原因时,我将第一步dna提取得到的dna溶液,每个样本取了6微升,用0.8%凝胶电泳跑电泳,结果maker条带依然很好,找了个老师看了一下,他说其他区域什么也没有。(是不是dna就没有提取出来?)
6、整个实验过程没有严格消毒。



于是这周我开始从DNA提取步骤开始查找原因,在第一步DNA抽提过程中,我发觉放入蛋白酶K后56度水浴三小时后,液体还是有絮状浑浊,似乎消化的很慢,后来第二次实验我加入了说明书上所写的两倍多的蛋白酶K的量,56度水浴过夜,第二天还是有一些絮状混浊,当然比第一次少一点,我就没管它,继续进行下面离心柱抽提dna,然后我把这两次提取的DNA,直接用0.8%的凝胶电泳跑电泳,紫外光下观察发现样品1出现的是从注入孔开始一长溜暗条带,而不是在某一位置有一个亮条带,样品2出现的是从注入孔开始一窄的纵向亮条带。我找了一个老师看,她说出现样品1的图可能因为dna的量太少,而且都是碎裂的DNA,各个长度的都有,出现样品2的图可能是注入样品时点状注入没有铺开,而且她说这样的DNA,如果勉强进行下面的甲基化修饰和PCR,很难出结果。
我想请教一下为什么抽提出这样的DNA,是不是石蜡标本的dna不好提取?还是本身就已经降解很多?还能进行下面的甲基化修饰和甲基化PCR吗?
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1,抽提DNA应该都没太大问题,如果你石蜡标本保存得当的话,DNA降解也几乎是可忽略的。

2,不要老以为你提的DNAl量少,提多了也没用,500ng足够了。

3,不要以为从文献中获得的引物序列就一定是好用的,你需要预实验确定其是否好用。如果石蜡样品很珍贵,可以拿卵巢癌细胞系提取基因组DNA进行MSP练手。

4,不知你最后PCR采用的DNA 聚合酶是什么酶?酶的选择对你的PCR扩增很重要。

5,总之,如果你的引物好用的话,MSP是比较好做的。
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请教LS,MSP的引物你自己设计么?
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用软件自己设计,Methyl Primer Express Software v1.0,尚好
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呵呵不是在线设计?用过这个吗?cuturl('http://www.urogene.org/methprimer/index1.html')

这个在线设计软件怎么样?我知道怎么设计,但从没使用过设计的引物,想知道一下这个设计出来的好用不好用。。。
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没用过这个。我用的那个软件设计引物3选2,一个为优,一个尚可。这些软件算法及策略应该都差不多吧
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选取的是转录起始点以上多少BP进行设计?
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是在CpG岛内进行设计,一般是在-500左右的区域,如果直接能找出island就更好了
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好,这个在线软件能看到CpG岛在什么位置,我昨天设计了一个引物,用-500bp和-1000bp同时设计,结果得到的引物是一样的,而用-2000bp就不一样。。。我个人也是觉得-500bp是最佳位置,谢谢指点!
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