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标题:求助：跑胶为什么成这样？[转自 丁香园论坛]

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发表于 2011-8-20 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：跑胶为什么成这样？[转自 丁香园论坛]

求助：跑胶为什么成这样？[转自 丁香园论坛]


跑出来的东西如下图。1和15道是marker，每个100bp；2-7是一个基因；8-13是另一个基因；14是actin。

上样：4 ul PCR产物，1 ul 6X的loading buffer，1 ul胶体金（染料）。

电泳的条件是120伏，40分钟，溴芬蓝能跑开，跑到胶的中段。目的条带是448，460和564 bp。

请问：1. 2-4泳道可以看到和marker基本一致的条带，有没有可能是marker渗过去的（开始加样的时候没有用TBE没过孔，所以加的似乎没有完全沉在孔底）？

2. 5-7泳道和其他泳道虽然是不同基因，但条带基本一致，为什么？是不是根本没有我要的基因，条带是降解（RNA降解？DNA降解？）形成的？

在此先谢谢各位！


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2011-8-20 13:06
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发表于 2011-8-20 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主MARKER没有同时加染料，是没有办法判断目的片段大小和位置啊，MARKER和目的基因在电泳时应该平行加染料。考虑到你的琼脂糖凝胶尾部有拖尾现象，应该可以排除染料失效的原因。请楼主考虑，你的目的基因是否已经条件成熟，如果只是在摸条件，这样的结果很正常，可以优化条件后进行电泳检测
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发表于 2011-8-20 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这样的图没必要拿上来，Marker跑的一无所知，条带拖尾严重，也不知掉具体大小，我只能说本次实验中任何一个环节都可能出问题了，总结不到有用的原因。你最好把实验再重做一次，起码你拿上来的电泳图不应该太儿戏吧？
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发表于 2011-8-20 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那么，我那些条带可能是社么呢？在溴芬蓝附近，应该是300 bp左右？

另外，我的电泳液直接是0.5X的TBE，没有别的东西，不知道会有问题吗？我以前一直是这样用的，不过我以前是用EB染色的。电泳液是不是应该有tris，edta这些东西？

再次感谢！
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发表于 2011-8-20 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 嘉年华 于 2011-8-20 13:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这样的图没必要拿上来，Marker跑的一无所知，条带拖尾严重，也不知掉具体大小，我只能说本次实验中任何一个环节都可能出问题了，总结不到有用的原因。你最好把实验再重做一次，起码你拿上来的电泳图不应该太儿戏吧？  ...

兄弟批评的是，我已经正在跑一个加了染料的marker。一会看看。

再次感谢。
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发表于 2011-8-20 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先排除marker的渗漏，如果是渗漏，不可能2-4泳道跑胶结果如此均一，奇怪的是你的每个泳道均出现了多带的情况，而且仔细看这些带型还比较一致、均一。不过如果注意到连你的阳性对照actin也出现了多带，那结果就无法分析了。理论上actin应该是单带，建议你做下阴性对照看看结果如何？只加引物而不加任何模板，我猜跑出来的带型也是这样。如果阴性对照也出现该情况，那就基本可以确定你的PCR体系已经被污染了。另外，不知道你PCR的模板是来至于DNA或是cDNA？如果可以，跑胶前最好点用一个孔点上同样体积的PCR模板。再上图分析。
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发表于 2011-8-20 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有点怀疑是模版的问题，我先跑一块胶，加模版（逆转录之后，PCR反应之前）试试，如果不行，我今晚在P一次。
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 小中大
又跑了一块。见下图...15是marker，14是beta-actin，8-13就逆转录后的DNA；1-6就目的基因；7是空的。

能否说明8，11，12，13所加人模版是没问题的？1-6一点产物也没有，如果是不表达，模版应该还在？


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 小中大
你的胶图上marker的条带跑的都不好，这至少说明你的胶制的不好，如果你每次用的都是新称量的琼脂糖最好在微波炉中热沸腾两次，这样保证胶是均一的。

1-6一点产物也没有，如果是不表达，模版应该还在？----注意，你做PCR时模板用量是多少？你又点了几微升的PCR产物，模板浓度在PCR反应体系中相当低跑胶不可能看得到；此外，如果你用的是反转录得到的cDNA模板，那么经过PCR循环反应，模板早降解了，也不能看得到了呀。
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 小中大
谢谢！actin没有东西，但DNA模版（我用的是13泳道的模版扩增的）没问题，说明应该就PCR体系出了问题。是这样分析吗？

8-13在加样孔稍下方有条带，是DNA吗？（这几个空加的就逆转录的产物）。

电泳条件是120v 40min。1.2%胶

如果8-13泳道加样孔稍下方的不是DNA，那就是反转录出问题了？
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