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标题:难以理解，为什么我的标准曲线CT值基本不变呢

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发表于 2011-8-20 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

难以理解，为什么我的标准曲线CT值基本不变呢

难以理解，为什么我的标准曲线CT值基本不变呢？[转自 丁香园论坛]


各位老师、前辈，我遇到一个难以理解的问题：

我是用SYBG相对定量的方法，开始时我想用△△Ct分析结果，发现结果和普通PCR的结果不同，因此我决定做相对定量的标准曲线，分别为目的基因的标准曲线和内参beta-actin的标准曲线，结果内参的标准曲线很好，而目的基因的Ct值基本没变化，请前辈指教！多谢！

数据如下

目的基因浓度 CT值 （5倍梯度稀释）

5^5
24.49

5^4
24.55

5^3
24.76

5^2
24.85

5^1
24.93
内参浓度 CT值

10^5
14.92

10^4
17.96

10^3
22.03

10^2
24.75

10^1
26.42
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发表于 2011-8-20 14:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用于稀释的样本是什么，是不是cDNA,如果是的话，当然有可能出现这个结果。内参由于丰度高，稀释之后ct有变化。而目的基因，本来copy数就很低，就会造成稀释不开。我试过用cDNA做标曲，结果线性很不好，改用质粒做后，线性就好了。
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 小中大
谢谢你，可是我还是不明白如果我的目的基因很少的话，我的扩增曲线起峰就会很晚才对，Ct值也会很大，但是我的起峰位置和Ct值都正常啊？怎么解释呢？
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 小中大
我不知道你是多少个cycle,Ct 25应该量也不算高。还有注意稀释用专门的稀释液，如takara的easy dilution.
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发表于 2011-8-20 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请注意污染~~~~~~~每次做都要带上negative control，就是不加模板的反应，检测反应体系本身是否有污染。如果反应体系中某一组分被污染，可能出现梯度稀释后Ct值不变的情况。
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发表于 2011-8-20 14:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意见：
1 稀释倍数过低。我们一般做7-8个点，稀释倍数取10倍比稀释。这样还有得选择。
2 不建议用cDNA跑标准曲线。因为它的浓度本不高，建议用PCR产物跑，理论上是一样的。我之前用cDNA跑，也是跑出各种结果，有的根本解释不清楚。
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发表于 2011-8-20 14:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用PCR产物做标曲，线性如何？我没有尝试过，直接做了质粒的。如果线性可以省得我做克隆了。
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 小中大
你用PCR产物做标曲，线性如何？我没有尝试过，直接做了质粒的。如果线性可以省得我做克隆了。
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发表于 2011-8-20 14:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
内参的标准浓度也太高了点，容易污染，不建议采用CT值在15以内的作为标准品；样品稀释的CT值都一致，很有可能是是污染了，实验室污染之后怎么稀释也是同一CT值。荧光PCR的灵敏度很高，每次都应该带有阴性对照。
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发表于 2011-8-20 14:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
CT值在15样品的拷贝数在10的9次方以上，样品的10000分之一污染都会造成假阳性的出现，标准曲线不建议采用这么强的样本制作，荧光PCR防污染很需要注意。
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